Real-Time Loop-Mediated Isothermal Amplification (RealAmp) for the Species-Specific Identification of Plasmodium vivax

• DOI: 10.1371/journal.pone.0054986
• Publication Date: 2013-01-22T22:54:39Z
• Authors: Jaymin C. Patel; Jenna Oberstaller; Maniphet Xayavong; Jothikumar Narayanan; Jeremy D. DeBarry; Ganesh Srinivasam...; Leopoldo Villegas; Ananias A. Escalante; Alexandre DaSilva; David S. Peterson; John W. Barnwell; Jessica C. Kissinger; Venkatachalam Udh...; Naomi W. Lucchi
• Keywords: Molecular biology; Science; Malaria Parasite; Plasmodium falciparum; Immunology; Sensitivity and Specificity; Gene; 03 medical and health sciences; 0302 clinical medicine; Species Specificity; Virology; Health Sciences; Malaria, Vivax; RNA, Ribosomal, 18S; Genetics; Humans; Global Impact of Arboviral Diseases; Biology; Internal medicine; Immunology and Microbiology; Gold standard (test); FOS: Clinical medicine; Q; R; Public Health, Environmental and Occupational Health; Life Sciences; Loop-mediated isothermal amplification; Malaria Parasites in Birds; DNA; Malaria; Polymerase chain reaction; 3. Good health; FOS: Biological sciences; Nested polymerase chain reaction; Medicine; Parasitology; Plasmodium vivax; Nucleic Acid Amplification Techniques; Research Article

لا تزال عدوى المتصورة النشيطة مصدرًا رئيسيًا للأمراض والوفيات المرتبطة بالملاريا. التشخيص المبكر والدقيق هو جزء لا يتجزأ من برامج مكافحة الملاريا الفعالة. توفر طرق التشخيص الجزيئي التقليدية نتائج دقيقة ولكنها غالبًا ما تكون كثيفة الاستخدام للموارد ومكلفة ولديها وقت طويل وتتجاوز قدرة معظم البلدان الموبوءة بالملاريا. طور مختبرنا مؤخرًا منصة جديدة تسمى RealAmp، والتي تجمع بين التضخيم الحراري المتساوي الحلقي (LAMP) مع ماسح ضوئي متساوي الحرارة محمول في الوقت الفعلي للكشف السريع عن طفيليات الملاريا. هنا نصف المواد التمهيدية الجديدة للكشف عن P. vivax باستخدام طريقة RealAmp. تم اشتقاق ثلاثة أزواج من بادئات التضخيم المطلوبة لهذه الطريقة من تسلسل الحمض النووي المحفوظ الفريد لجينوم P. vivax. تم إجراء التضخيم عند 64 درجة مئوية باستخدام أصباغ SYBR الخضراء أو SYTO -9 المتداخلة لمدة 90 دقيقة مع ضبط الماسح الضوئي الأنبوبي لجمع إشارات التألق على فترات مدتها دقيقة واحدة. تم استخدام العينات السريرية من P. vivax وغيرها من أنواع طفيليات الملاريا التي تصيب الإنسان لتحديد حساسية وخصوصية البرايمر من خلال المقارنة مع تفاعل البوليميراز المتداخل القائم على الحمض النووي الريبي 18s كمعيار ذهبي. اكتشفت المجموعة الجديدة من البرايمر باستمرار عزلات محتفظ بها مختبريًا من P. vivax من أجزاء مختلفة من العالم. اكتشفت المواد التمهيدية P. vivax في العينات السريرية بحساسية 94.59 ٪ (95 ٪ CI: 87.48-98.26 ٪) وخصوصية 100 ٪ (95 ٪ CI: 90.40-100 ٪) مقارنة بطريقة PCR المتداخلة القياسية الذهبية. أثبتت المواد التمهيدية الجديدة أيضًا أنها أكثر حساسية من المواد التمهيدية المنشورة الخاصة بالأنواع والتي تم تطويرها خصيصًا لطريقة LAMP في الكشف عن P. vivax.<br/>Les infections à Plasmodium vivax restent une source majeure de morbidité et de mortalité liées au paludisme. Un diagnostic précoce et précis fait partie intégrante de programmes efficaces de lutte contre le paludisme. Les méthodes de diagnostic moléculaire conventionnelles fournissent des résultats précis, mais sont souvent gourmandes en ressources, coûteuses, ont un long délai d'exécution et dépassent la capacité de la plupart des pays où le paludisme est endémique. Notre laboratoire a récemment développé une nouvelle plate-forme appelée RealAmp, qui combine l'amplification isotherme à médiation par boucle (LAMP) avec un instrument isotherme en temps réel à scanner à tube portable pour la détection rapide des parasites du paludisme. Nous décrivons ici de nouvelles amorces pour la détection de P. vivax en utilisant la méthode RealAmp. Trois paires d'amorces d'amplification requises pour cette méthode ont été dérivées d'une séquence d'ADN conservée unique au génome de P. vivax. L'amplification a été réalisée à 64°C à l'aide de colorants intercalants SYBR Green ou SYTO-9 pendant 90 minutes avec le scanner à tube réglé pour collecter les signaux de fluorescence à des intervalles de 1 minute. Des échantillons cliniques de P. vivax et d'autres espèces de parasites du paludisme infectant l'homme ont été utilisés pour déterminer la sensibilité et la spécificité des amorces en les comparant à une PCR nichée à base d'ARN ribosomique 18S comme étalon-or. Le nouvel ensemble d'amorces a systématiquement détecté des isolats de P. vivax conservés en laboratoire dans différentes parties du monde. Les amorces ont détecté P. vivax dans les échantillons cliniques avec une sensibilité de 94,59 % (IC à 95 % : 87,48-98,26 %) et une spécificité de 100 % (IC à 95 % : 90,40-100 %) par rapport à la méthode de PCR imbriquée de référence. Les nouvelles amorces se sont également révélées plus sensibles que les amorces spécifiques aux espèces publiées spécifiquement développées pour la méthode LAMP dans la détection de P. vivax.<br/>Las infecciones por Plasmodium vivax siguen siendo una fuente importante de morbilidad y mortalidad relacionadas con la malaria. El diagnóstico temprano y preciso es un componente integral de los programas efectivos de control de la malaria. Los métodos convencionales de diagnóstico molecular proporcionan resultados precisos, pero a menudo requieren muchos recursos, son costosos, tienen un largo tiempo de respuesta y están más allá de la capacidad de la mayoría de los países donde la malaria es endémica. Nuestro laboratorio ha desarrollado recientemente una nueva plataforma llamada RealAmp, que combina la amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) con un instrumento isotérmico portátil de escáner de tubos en tiempo real para la detección rápida de parásitos de la malaria. Aquí describimos nuevos cebadores para la detección de P. vivax mediante el método RealAmp. Tres pares de cebadores de amplificación necesarios para este método se derivaron de una secuencia de ADN conservada única para el genoma de P. vivax. La amplificación se llevó a cabo a 64 °C utilizando tintes intercalantes SYBR Green o SYTO-9 durante 90 minutos con el escáner de tubo configurado para recoger señales de fluorescencia a intervalos de 1 minuto. Se utilizaron muestras clínicas de P. vivax y otras especies de parásitos de la malaria que infectan a los humanos para determinar la sensibilidad y especificidad de los cebadores mediante la comparación con una PCR anidada basada en ARN ribosómico 18S como estándar de oro. El nuevo conjunto de cebadores detectó consistentemente aislados mantenidos en laboratorio de P. vivax de diferentes partes del mundo. Los cebadores detectaron P. vivax en las muestras clínicas con una sensibilidad del 94,59% (IC del 95%: 87,48-98,26%) y una especificidad del 100% (IC del 95%: 90,40-100%) en comparación con el método de PCR anidada estándar de oro. Los nuevos cebadores también demostraron ser más sensibles que los cebadores específicos de especie publicados desarrollados específicamente para el método LAMP en la detección de P. vivax.<br/>Plasmodium vivax infections remain a major source of malaria-related morbidity and mortality. Early and accurate diagnosis is an integral component of effective malaria control programs. Conventional molecular diagnostic methods provide accurate results but are often resource-intensive, expensive, have a long turnaround time and are beyond the capacity of most malaria-endemic countries. Our laboratory has recently developed a new platform called RealAmp, which combines loop-mediated isothermal amplification (LAMP) with a portable tube scanner real-time isothermal instrument for the rapid detection of malaria parasites. Here we describe new primers for the detection of P. vivax using the RealAmp method. Three pairs of amplification primers required for this method were derived from a conserved DNA sequence unique to the P. vivax genome. The amplification was carried out at 64°C using SYBR Green or SYTO-9 intercalating dyes for 90 minutes with the tube scanner set to collect fluorescence signals at 1-minute intervals. Clinical samples of P. vivax and other human-infecting malaria parasite species were used to determine the sensitivity and specificity of the primers by comparing with an 18S ribosomal RNA-based nested PCR as the gold standard. The new set of primers consistently detected laboratory-maintained isolates of P. vivax from different parts of the world. The primers detected P. vivax in the clinical samples with 94.59% sensitivity (95% CI: 87.48-98.26%) and 100% specificity (95% CI: 90.40-100%) compared to the gold standard nested-PCR method. The new primers also proved to be more sensitive than the published species-specific primers specifically developed for the LAMP method in detecting P. vivax.<br/>