The Challenge of Stability in High-Throughput Gene Expression Analysis: Comprehensive Selection and Evaluation of Reference Genes for BALB/c Mice Spleen Samples in the Leishmania infantum Infection Model

• DOI: 10.1371/journal.pone.0163219
• Publication Date: 2016-09-26T17:36:20Z
• Authors: Yasmina E. Hernan...; Eduardo Ontoria; Ana C. Gonzalez-G...; M. Antonieta Quis...; Vicente Larraga; Basilio Valladares; Emma Carmelo
• Keywords: 0301 basic medicine; Science; Immunology; Dynamics of Livestock Disease Transmission and Control; Infantum; Recombinant Protein Production in Mammalian and Insect Cells; http://purl.org/pe-repo/ocde/ford#1.06.01; Real-Time Polymerase Chain Reaction; Gene; BALB; Agricultural and Biological Sciences; Computational biology; 03 medical and health sciences; Biochemistry, Genetics and Molecular Biology; Parasite hosting; Genetics; Leishmania infantum; Evaluation; Housekeeping gene; Molecular Biology; Biology; Leishmaniasis; Leishmania major; Leishmania; Visceral leishmaniasis; FOS: Clinical medicine; Q; R; Life Sciences; Computer science; 3. Good health; World Wide Web; Immune system; FOS: Biological sciences; Medicine; Real-Time PCR; Gene expression; Infection; Reference genes; Transcriptome; BALB/c; Stability; Agronomy and Crop Science; Spleen; Research Article

يؤدي تفاعل الليشمانيا مع فئران BALB/c إلى تغييرات جذرية في أنماط النسخ في الطفيلي، ولكن أيضًا في الأعضاء المستهدفة (الطحال والكبد...) بسبب استجابتها ضد العدوى. يعد تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي (qPCR) نهجًا مثيرًا للاهتمام لتحليل هذه التغييرات وفهم المسارات المناعية التي تؤدي إلى الحماية من المرض أو تطوره. ومع ذلك، يجب تطبيع نتائج QPCR مقابل واحد أو أكثر من الجينات المرجعية (RG) لتصحيح الاختلاف التجريبي غير المحدد. اعترف تطوير المنصات التقنية لتحليل qPCR عالي الإنتاجية، والبرمجيات القوية لتحليل بيانات qPCR، بالمشكلة المتمثلة في أن بعض الجينات المرجعية المستخدمة على نطاق واسع بسبب أدوارها المعروفة أو المشتبه بها في "التدبير المنزلي"، يجب تجنبها بسبب تباين التعبير العالي عبر الأنسجة المختلفة أو الظروف التجريبية. في هذه الورقة، قمنا بتقييم استقرار 112 جينًا باستخدام ثلاث خوارزميات مختلفة: geNorm و NormFinder و RefFinder في عينات الطحال من فئران BALB/c في ظل ظروف تجريبية مختلفة (فئران التحكم والفئران المصابة بالليشمانيا الطفلية). على الرغم من التناقضات الطفيفة في ترتيب الاستقرار الذي تظهره الطرق الثلاث، فإن معظم الجينات تظهر أداءً مشابهًا جدًا لـ RG (سواء كان جيدًا أو ضعيفًا) عبر مجموعة البيانات الضخمة هذه. تظهر نتائجنا أن بعض الجينات المستخدمة تقليديًا كـ RG في هذا النموذج (أي B2m و Polr2a و Tbp) يتفوق عليها الآخرون بشكل واضح. على وجه الخصوص، تم تحديد مزيج Il2rg + Itgb2 من بين أفضل المرشحين لتسجيل نقاط RG لكل مجموعة من الفئران وكل خوارزمية مستخدمة في هذا النموذج التجريبي. أخيرًا، أثبتنا أن استخدام RG "التقليدي" مقابل المختار بعقلانية لتطبيع بيانات التعبير الجيني قد يؤدي إلى فقدان الأهمية الإحصائية لتغيرات التعبير الجيني عند استخدام منصات واسعة النطاق، وبالتالي سوء تفسير النتائج. تسلط نتائجنا مجتمعة الضوء على الحاجة إلى بحث شامل وعالي الإنتاجية عن الجينات المرجعية الأكثر استقرارًا في كل نموذج تجريبي معين.<br/>L'interaction de Leishmania avec les souris BALB/c induit des changements dramatiques dans les schémas transcriptomiques du parasite, mais aussi dans les organes cibles (rate, foie…) en raison de sa réponse contre l'infection. La PCR quantitative en temps réel (qPCR) est une approche intéressante pour analyser ces changements et comprendre les voies immunologiques qui conduisent à la protection ou à la progression de la maladie. Cependant, les résultats de la qPCR doivent être normalisés par rapport à un ou plusieurs gènes de référence (RG) pour corriger la variation expérimentale non spécifique. Le développement de plates-formes techniques pour l'analyse de la qPCR à haut débit, et de logiciels puissants pour l'analyse des données de la qPCR, ont reconnu le problème que certains gènes de référence largement utilisés en raison de leurs rôles « d'entretien » connus ou soupçonnés, devraient être évités en raison de la grande variabilité d'expression entre les différents tissus ou conditions expérimentales. Dans cet article, nous avons évalué la stabilité de 112 gènes à l'aide de trois algorithmes différents : geNorm, NormFinder et RefFinder dans des échantillons de rate de souris BALB/c dans différentes conditions expérimentales (souris témoins et souris infectées par Leishmania infantum). Malgré de légères divergences dans le classement de stabilité montré par les trois méthodes, la plupart des gènes présentent des performances très similaires à celles de RG (bonnes ou mauvaises) dans cet ensemble de données massif. Nos résultats montrent que certains des gènes traditionnellement utilisés comme RG dans ce modèle (c'est-à-dire B2m, Polr2a et Tbp) sont clairement surperformés par d'autres. En particulier, la combinaison d'Il2rg + Itgb2 a été identifiée parmi le meilleur candidat de score RG pour chaque groupe de souris et chaque algorithme utilisé dans ce modèle expérimental. Enfin, nous avons démontré que l'utilisation de RG « traditionnels » par rapport à des RG sélectionnés rationnellement pour la normalisation des données d'expression génique peut entraîner une perte de signification statistique des changements d'expression génique lors de l'utilisation de plates-formes à grande échelle, et donc une mauvaise interprétation des résultats. Pris ensemble, nos résultats soulignent la nécessité d'une recherche complète et à haut débit des gènes de référence les plus stables dans chaque modèle expérimental particulier.<br/>La interacción de Leishmania con ratones BALB/c induce cambios dramáticos en los patrones del transcriptoma en el parásito, pero también en los órganos diana (bazo, hígado...) debido a su respuesta contra la infección. La PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) es un enfoque interesante para analizar estos cambios y comprender las vías inmunológicas que conducen a la protección o progresión de la enfermedad. Sin embargo, los resultados de qPCR deben normalizarse contra uno o más genes de referencia (RG) para corregir la variación experimental no específica. El desarrollo de plataformas técnicas para el análisis de qPCR de alto rendimiento, y un potente software para el análisis de datos de qPCR, han reconocido el problema de que algunos genes de referencia ampliamente utilizados debido a sus funciones de "limpieza" conocidas o sospechadas, deben evitarse debido a la alta variabilidad de expresión en diferentes tejidos o condiciones experimentales. En este artículo evaluamos la estabilidad de 112 genes utilizando tres algoritmos diferentes: geNorm, NormFinder y RefFinder en muestras de bazo de ratones BALB/c en diferentes condiciones experimentales (ratones control e infectados con Leishmania infantum). A pesar de las pequeñas discrepancias en la clasificación de estabilidad que muestran los tres métodos, la mayoría de los genes muestran un rendimiento muy similar al de RG (bueno o malo) en este conjunto masivo de datos. Nuestros resultados muestran que algunos de los genes utilizados tradicionalmente como RG en este modelo (es decir, B2m, Polr2a y Tbp) son claramente superados por otros. En particular, la combinación de Il2rg + Itgb2 se identificó entre los RG candidatos con mejor puntuación para cada grupo de ratones y cada algoritmo utilizado en este modelo experimental. Finalmente, hemos demostrado que el uso de RG "tradicional" frente a RG seleccionado racionalmente para la normalización de los datos de expresión génica puede conducir a la pérdida de significación estadística de los cambios en la expresión génica cuando se utilizan plataformas a gran escala y, por lo tanto, a una interpretación errónea de los resultados. En conjunto, nuestros resultados resaltan la necesidad de una búsqueda exhaustiva y de alto rendimiento de los genes de referencia más estables en cada modelo experimental particular.<br/>The interaction of Leishmania with BALB/c mice induces dramatic changes in transcriptome patterns in the parasite, but also in the target organs (spleen, liver…) due to its response against infection. Real-time quantitative PCR (qPCR) is an interesting approach to analyze these changes and understand the immunological pathways that lead to protection or progression of disease. However, qPCR results need to be normalized against one or more reference genes (RG) to correct for non-specific experimental variation. The development of technical platforms for high-throughput qPCR analysis, and powerful software for analysis of qPCR data, have acknowledged the problem that some reference genes widely used due to their known or suspected "housekeeping" roles, should be avoided due to high expression variability across different tissues or experimental conditions. In this paper we evaluated the stability of 112 genes using three different algorithms: geNorm, NormFinder and RefFinder in spleen samples from BALB/c mice under different experimental conditions (control and Leishmania infantum-infected mice). Despite minor discrepancies in the stability ranking shown by the three methods, most genes show very similar performance as RG (either good or poor) across this massive data set. Our results show that some of the genes traditionally used as RG in this model (i.e. B2m, Polr2a and Tbp) are clearly outperformed by others. In particular, the combination of Il2rg + Itgb2 was identified among the best scoring candidate RG for every group of mice and every algorithm used in this experimental model. Finally, we have demonstrated that using "traditional" vs rationally-selected RG for normalization of gene expression data may lead to loss of statistical significance of gene expression changes when using large-scale platforms, and therefore misinterpretation of results. Taken together, our results highlight the need for a comprehensive, high-throughput search for the most stable reference genes in each particular experimental model.<br/>