Cerebral malaria is associated with differential cytoadherence to brain endothelial cells
Male
0301 basic medicine
Medicine (General)
Erythrocytes
QH426-470
Computational biology
Child
Cells, Cultured
Immunology and Microbiology
Brain
Life Sciences
3. Good health
Child, Preschool
Microcephaly
Medicine
cerebral malaria
Female
Cerebral Malaria
Cell biology
Plasmodium falciparum
Immunology
Malaria, Cerebral
Models, Biological
Endothelial stem cell
Global Impact of Helminth Infections and Control Strategies
Blood–brain barrier
03 medical and health sciences
R5-920
In vitro
Report
Virology
Health Sciences
Cell Adhesion
Genetics
Humans
Global Impact of Arboviral Diseases
Biology
paediatric patient isolates
FOS: Clinical medicine
Public Health, Environmental and Occupational Health
Endothelial Cells
Infant
Malaria
PfEMP1
Central nervous system
FOS: Biological sciences
cytoadherence
Parasitology
Neuroscience
DOI:
10.15252/emmm.201809164
Publication Date:
2019-01-04T12:35:12Z
AUTHORS (12)
ABSTRACT
تقرير 4 يناير 2019 الوصول المفتوح عملية شفافة ترتبط الملاريا الدماغية بالارتباط الخلوي التفاضلي بالخلايا البطانية للدماغ جانيت ستورم المؤلفة المقابلة جانيت ستورم [البريد الإلكتروني محمي] orcid.org/0000-0001-7812-4220 قسم علم الطفيليات، كلية ليفربول للطب الاستوائي، ليفربول، المملكة المتحدة ملاوي - ليفربول - ويلكوم ترست برنامج البحوث السريرية، بلانتاير، كلية ملاوي للطب، جامعة ملاوي، بلانتاير، ملاوي البحث عن المزيد من الأوراق من قبل هذا المؤلف جاكوب سيسبيرسن جاكوب سيسبيرسن orcid.org/0000-0002-4930-5900 قسم الصحة الدولية، علم المناعة وعلم الأحياء الدقيقة، مركز علم الطفيليات الطبية، جامعة كوبنهاغن، كوبنهاغن، الدنمارك قسم الأمراض المعدية، ريجشوسبيتاليت، كوبنهاغن، الدنمارك البحث عن المزيد من الأبحاث من قبل هذا المؤلف كارل ب سيدل كارل ب سيدل كلية الطب، جامعة ملاوي، بلانتاير، مشروع ملاوي بلانتاير للملاريا، كلية الطب، جامعة ملاوي، بلانتاير، قسم ملاوي للتخصصات الطبية التقويمية، كلية طب العظام، جامعة ولاية ميشيغان، شرق لانسينغ، ميشيغان، الولايات المتحدة الأمريكية البحث عن المزيد من الأبحاث من قبل هذا المؤلف تادج سيستاك تادج سيستاك قسم علم الطفيليات، كلية ليفربول للطب الاستوائي، ليفربول، المملكة المتحدة البحث عن المزيد من الأبحاث من قبل هذا المؤلف موريس مبيوي موريس مبيوي ملاوي- ليفربول- ويلكوم ترست للأبحاث السريرية Program, Blantyre, Malawi Search for more papers by this author Ngawina V Chisala Ngawina V Chisala Malawi - Liverpool - Wellcome Trust Clinical Research Programme, Blantyre, Malawi Search for more papers by this author Patricia Phula Patricia Phula Malawi - Liverpool - Wellcome Trust Clinical Research Programme, Blantyre, Malawi Search for more papers by this author Christian Wang Christian Wang Wang Department of International Health, Immunology & Microbiology, Centre for Medical Parasitology, University of Copenhagen, Copenhagen, Denmark Department of Infectious Diseases, Rigshospitalet, Copenhagen, Denmark Search for more papers by this author Terrie E Taylor Terrie E Taylor Blantyre Malaria Project, College of Medicine, University of Malawi, Blantyre, Malawi Department of Osteopathic Medical Specialties, College of Osteopathic Medicine, Michigan State University, East Lansing, MI, USA البحث عن المزيد من الأوراق من قبل هذا المؤلف كريستوفر أ. موكسون معهد كريستوفر أ. موكسون للعدوى والصحة العالمية, University of Liverpool, Liverpool, UK Wellcome Centre for Molecular Parasitology, Institute of Infection, Immunity and Inflammation, College of Medical Veterinary & Life Sciences, University of Glasgow, Glasgow, UK البحث عن المزيد من الأوراق من قبل هذا المؤلف توماس لافستين توماس لافستسن orcid.org/0000-0002-3044-4249 قسم الصحة الدولية والمناعة والأحياء الدقيقة، مركز علم الطفيليات الطبية، جامعة كوبنهاغن، كوبنهاغن، الدنمارك قسم الأمراض المعدية، ريغشوسبيتاليت، كوبنهاغن، الدنمارك البحث عن المزيد من الأوراق من قبل هذا المؤلف أليستر ج كريج المؤلف المراسل أليستر ج كريج [البريد الإلكتروني محمي] orcid.org/0000-0003-0914-6164 قسم علم الطفيليات، كلية ليفربول للطب الاستوائي، ليفربول، المملكة المتحدة البحث عن المزيد من الأوراق من قبل هذا المؤلف جانيت ستورم المؤلف المراسل جانيت ستورم [البريد الإلكتروني محمي] orcid.org/0000-0001-7812-4220 قسم علم الطفيليات، كلية ليفربول للطب الاستوائي، ليفربول، المملكة المتحدة مالاوي - ليفربول - ويلكوم ترست برنامج البحوث السريرية، بلانتير، كلية ملاوي للطب، جامعة ملاوي، بلانتاير، ملاوي البحث عن المزيد من الأبحاث لهذا المؤلف جاكوب إس جيسبرسن جاكوب إس جيسبرسن orcid.org/0000-0002-4930-5900 قسم الصحة الدولية والمناعة وعلم الأحياء الدقيقة، مركز علم الطفيليات الطبية، جامعة كوبنهاغن، كوبنهاغن، الدنمارك قسم الأمراض المعدية، ريجشوسبيتاليت، كوبنهاجن، الدنمارك البحث عن المزيد من الأبحاث لهذا المؤلف كارل ب سيدل كارل ب سيدل كلية الطب، جامعة ملاوي، بلانتاير، ملاوي مشروع بلانتاير مالاريا، كلية الطب، جامعة ملاوي، بلانتاير، ملاوي قسم التخصصات الطبية التقويمية، كلية طب تقويم العظام، جامعة ولاية ميشيغان، إيست لانسينغ، ميشيغان، الولايات المتحدة الأمريكية البحث عن المزيد من الأوراق من قبل هذا المؤلف تادج سيستاك تادج سيستاك قسم علم الطفيليات، كلية ليفربول للطب الاستوائي، ليفربول، المملكة المتحدة البحث عن المزيد من الأوراق من قبل هذا المؤلف موريس مبيوي موريس مبيوي ملاوي ليفربول ويلكوم ترست برنامج البحوث السريرية، بلانتاير، ملاوي البحث عن المزيد من الأوراق من قبل هذا المؤلف نغاوينا الخامس شيسالا نغاوينا الخامس شيسالا مالاوي ليفربول ويلكوم ترست برنامج البحوث السريرية، بلانتاير، ملاوي البحث عن المزيد من الأوراق من قبل هذا المؤلف باتريشيا فولا باتريشيا فولا مالاوي ليفربول ويلكوم ترست برنامج البحوث السريرية، بلانتاير، ملاوي البحث عن المزيد من الأوراق من قبل هذا المؤلف كريستيان وانغ كريستيان وانغ قسم الصحة الدولية والمناعة وعلم الأحياء الدقيقة، مركز علم الطفيليات الطبية، جامعة كوبنهاغن، كوبنهاغن، الدنمارك قسم الأمراض المعدية، ريغشوسبيتاليت، كوبنهاغن، الدنمارك البحث عن المزيد من الأوراق من قبل هذا المؤلف تيري إي تايلور تيري إي تايلور بلانتير مشروع الملاريا، كلية الطب، جامعة ملاوي، بلانتير، ملاوي قسم التخصصات الطبية التقويمية، كلية طب العظام، جامعة ولاية ميشيغان، إيست لانسينغ، ميشيغان، الولايات المتحدة الأمريكية البحث عن المزيد من الأوراق من قبل هذا المؤلف كريستوفر أ. موكسون كريستوفر أ Moxon Institute of Infection and Global Health, University of Liverpool, Liverpool, UK Wellcome Centre for Molecular Parasitology, Institute of Infection, Immunity and Inflammation, College of Medical Veterinary & Life Sciences, University of Glasgow, Glasgow, UK Search for more papers by this author Thomas Lavstsen Thomas Lavstsen orcid.org/0000-0002-3044-4249 Department of International Health, Immunology & Microbiology, Centre for Medical Parasitology, University of Copenhagen, Copenhagen, Denmark Department of Infectious Diseases, Rigshospitalet, Copenhagen, Denmark Search for more papers by this author Alister G Craig Corresponding Author Alister G Craig [email protected] orcid.org/0000-0003-0914-6164 Department of علم الطفيليات، مدرسة ليفربول للطب الاستوائي، ليفربول، المملكة المتحدة البحث عن المزيد من الأوراق من قبل هذا المؤلف معلومات جانيت ستورم *، 1،2،3، جاكوب إس جيسبرسين 4،5، كارل بي سيدل 3،6،7، تادج سيستاك 1، موريس مبيوي 2، نغاوينا في شيسالا 2، باتريشيا فولا 2، كريستيان وانغ 4،5، تيري إي تايلور 6،7، كريستوفر أ موكسون 8،9، توماس لافستسن 4،5 وأليستر جريج *، 1 1 قسم علم الطفيليات، مدرسة ليفربول للطب الاستوائي، ليفربول، المملكة المتحدة 2 ملوي- ليفربول- ويلكوم ترست ترست برنامج البحوث السريرية، بلانتير، ملاوي 3 كلية الطب، جامعة ملاوي، بلانتير، ملاوي 4 قسم الصحة الدولية، علم المناعة وعلم الأحياء الدقيقة، لعلم الطفيليات الطبية، جامعة كوبنهاغن، كوبنهاغن، الدنمارك 5 قسم الأمراض المعدية، ريغشوسبيتاليت، كوبنهاغن، الدنمارك 6 مشروع ملاريا بلانتاير، كلية الطب، جامعة ملاوي، بلانتاير، ملاوي 7 قسم التخصصات الطبية التقويمية، كلية الطب التقويمي، جامعة ولاية ميشيغان، إيست لانسينغ، ميشيغان، الولايات المتحدة الأمريكية 8 معهد العدوى والصحة العالمية، جامعة ليفربول، ليفربول، المملكة المتحدة 9 مركز ويلكوم لعلم الطفيليات الجزيئية، معهد العدوى والمناعة والالتهابات، كلية الطب البيطري والعلوم الحياتية، جامعة غلاسكو، غلاسكو، المملكة المتحدة * المؤلف المراسل. هاتف: +44 151 705 3297 ؛ البريد الإلكتروني: [البريد الإلكتروني محمي] * المؤلف المراسل. هاتف: +44 151 705 3161 ؛ البريد الإلكتروني: [email protected] EMBO Mol Med (2019)11: e9164https://doi.org/10.15252/emmm.201809164 PDFتنزيل ملف PDF لنص المقالة والأرقام الرئيسية. مراجعة الأقران قم بتنزيل ملخص لعملية اتخاذ القرار التحريري بما في ذلك خطابات القرار التحريري وتعليقات المراجعين وردود المؤلفين على التعليقات. أدواتإضافة إلى المفضلةتنزيل الاقتباساتتتبع الاقتباساتالصلاحيات ShareFacebookTwitterLinked InMendeleyWechatReddit Figures & Info Abstract Sequestration of Plasmodium falciparum - infected erythrocytes (IE) within the brain microvasculature is a charactermark of cerebral malaria (CM). باستخدام اختبار التصاق تدفق القنوات الدقيقة مع الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة الأولية التي يتم تنشيطها بواسطة TNF، أظهرنا أن IE المعزولة عن حالات CM للأطفال في ملاوي أظهرت زيادة الارتباط بالخلايا البطانية الوعائية الدقيقة في الدماغ مقارنة بـ IE من حالات الملاريا غير المعقدة (UM). علاوة على ذلك، أظهرت عزلات UM التصاقًا أكبر بكثير بالجلد من الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة في الدماغ. الوسيط الرئيسي للالتصاق الطفيلي هو P. falciparum بروتين غشاء كريات الدم الحمراء 1، المشفرة بواسطة جينات VAR. تم اكتشاف مستويات أعلى من نسخ الجينات VAR التي من المتوقع أن تربط مستقبلات البروتين البطاني المضيف C (ePCR) و ICAM -1 في عزلات CM. توفر هذه البيانات مزيدًا من الأدلة على ارتباط الأنسجة التفاضلية في متلازمات الملاريا الحادة وغير المعقدة، وتعطي دعمًا إضافيًا للفرضية القائلة بأن علم أمراض CM يعتمد على زيادة الارتباط الخلوي لـ IE في الأوعية الدموية الدقيقة في الدماغ. ملخص الالتصاق الخلوي لخلايا الدم الحمراء المصابة بالمتصورة المنجلية (IE) بالخلايا البطانية التي تبطن الأوعية الدماغية هي سمة مميزة للملاريا الدماغية (CM). تُظهر هذه الدراسة أن قدرة IE على الالتصاق الخلوي في دماغ المرضى الذين يعانون من CM والملاريا غير المعقدة مرتبطة بالمرض. IE من الأطفال المصابين بالملاريا غير المعقدة لا يرتبطون جيدًا بالخلايا البطانية للدماغ، في حين أن IE من مرضى CM يظهرون مستويات عالية من الارتباط. شوهدت ارتباطات كبيرة في ارتباط IE بالخلايا البطانية للدماغ لكل من ICAM -1 و EPCR. ارتبطت متغيرات PfEMP1 التي تحتوي على زخارف ملزمة لـ EPCR بالملاريا الدماغية. مقدمة على الرغم من الانخفاض الكبير في معدلات الوفيات والاعتلال الناجمة عن الملاريا في العقد الماضي، فإن النسبة المئوية للمرضى المصابين بالمتصورة المنجلية الذين يستسلمون للملاريا الحادة (SM) لا تتغير (منظمة الصحة العالمية، 2017)، حيث تساهم الملاريا الدماغية (CM) في الكثير من الوفيات. يبلغ معدل الوفيات الإجمالي لـ CM عند الأطفال 15-25 ٪، حيث أظهرت دراسة حديثة للتصوير بالرنين المغناطيسي أن تورم الدماغ يرتبط بقوة بالنتيجة المميتة في CM (Seydel et al، 2015). تمت دراسة أمراض CM على نطاق واسع (Idro et al، 2005 ؛ Hawkes et al، 2013) ولكن تمت مناقشتها أيضًا لعدة عقود، كما نوقش في العديد من المراجعات (Shikani et al، 2012 ؛ Cunnington et al، 2013 ؛ Storm & Craig، 2014 ؛ Wassmer & Grau، 2017). ما هو واضح هو أن التسبب في المرض متعدد العوامل، مع دور للاستجابة المناعية لعدوى المتصورة (Hunt & Grau، 2003 ؛ Ioannidis et al، 2014 ؛ Dieye et al، 2016 ؛ Mandala et al، 2017 ؛ Wolf et al، 2017) وعرقلة الأوعية الدموية الدقيقة عن طريق العزل والورد (Rowe et al، 2009 ؛ Craig et al، 2012 ؛ Ponsford et al، 2012 ؛ White et al، 2013 ؛ Milner et al، 2015)، مما يؤدي إلى خلل وظيفي بطاني. عزل كريات الدم الحمراء المصابة بالشلل المنجلي (IE) في الأوعية الدموية الدقيقة في الدماغ هو سمة مميزة لـ CM البشري كما هو موضح في دراسات ما بعد الوفاة (Pongponratn et al، 1991 ؛ Taylor et al، 2004)، ولكن كان من الصعب إثبات ما إذا كان هذا العزل ناتجًا عن الارتباط التفاضلي لـ IE ببطانة الدماغ. الوسيط الرئيسي للالتزام الخلوي للطفيلي بالبطانة هو بروتين غشاء كريات الدم الحمراء المنجلية 1 (PfEMP1)، وهو مستضد سطحي متغير يتم التعبير عنه على المقابض على سطح IE ويتم ترميزه بواسطة ما يقرب من 60 جينًا مختلفًا لكل جينوم طفيلي، مع التعبير عن PfEMP1 واحد فقط على سطح أي IE فردي (Scherf et al، 2008 ؛ Pasternak & Dzikowski، 2009). يتكون PfEMP1 من العديد من المجالات الشبيهة بالربط Duffy (DBL) والمنطقة بين المجالات الغنية بالسيستين (CIDR) ويمكن تصنيفها إلى أربع مجموعات رئيسية A و B و C و E بناءً على تسلسل المنبع 5بوصة لجين VAR المشفر (الشكل 1 ؛ سميث، 2014). يرتبط PfEMP1 بمجموعة من المستقبلات ويتضمن CD36 الحصري المتبادل ومستقبلات البروتين C البطانية (ePCR) - الأنماط الظاهرية الملزمة، بوساطة مجالات CIDR الطرفية N (Kraemer & Smith، 2006 ؛ Semblat et al، 2006، 2015 ؛ Rask et al، 2010 ؛ Hviid & Jensen، 2015). يرتبط ما يقرب من نصف المجموعة A PfEMP1 ومجموعة فرعية من المجموعة B/A chimeric PfEMP1، والمعروفة أيضًا باسم كاسيت المجال 8 (DC8)، بـ ePCR عبر نطاقات CIDRα 1، في حين تربط المجموعة B و C PfEMP 1 CD36 عبر نطاقات CIDRα 2 - CIDRα 6. بالإضافة إلى ذلك، يتم التوسط في الارتباط بجزيء الالتصاق بين الخلايا 1 (ICAM -1) عبر نطاقات DBLβ المجاورة لنطاقات CIDR وفي بعض الحالات تم ربطه بنمط ظاهري مزدوج الارتباط مع EPCR (Lennartz et al، 2017). الشكل 1. هيكل مجال PfEMP1 عرض تخطيطي لهيكل مجال PfEMP1 يشتمل على هيكل رأس N - terminal، ومجالات طرفية C لاحقة 2-6، ونطاق عبر الغشاء (TM) وقطاع طرفي حمضي داخل الخلايا (ATS) مع مستقبلات معروفة مشار إليها بخط عريض. يتم تحديد خصوصية المستقبلات من خلال نطاقات DBL و CIDR مجتمعة مع ارتباط حصري متبادل بـ EPCR و CD36 من خلال نطاقات CIDRα المختلفة في الهيكل الرئيسي. يرتبط جزء من المجموعة A PfEMP1 ومجموعة فرعية معينة من المجموعة B/A chimeric PfEMP1 (DC8) بـ ePCR عبر نطاقات CIDRα 1، بينما تربط المجموعة B و C PfEMP 1 CD36 عبر نطاقات CIDRα 2-6. تربط المجموعة غير النمطية E VAR2CSA PfEMP1 كبريتات شوندروتن المشيمة A (CSA) عبر نطاقات DBLpam1 و DBLpam2. النمط الظاهري الملزم لنطاقات VAR 1 و VAR 3 والمجموعة A CIDRβ/γ/δ غير معروف، لكنها لا تربط ePCR أو CD 36. يمكن أن تشارك نطاقات DBLβ في ربط ICAM -1 وهي من كلتا المجموعتين A و B. لا يُعرف الكثير عن نطاقات DBL الأخرى (γ/δ/ε/ تنزيل الشكل تنزيل PowerPoint عند اختيار مستقبلات المضيف التي يجب دراستها، أخذنا في الاعتبار النتائج التي ترتبط بها أيضًا فئات أنواع PfEMP1 بالتعبير في الجسم الحي في SM. ومن الأمثلة القوية على ذلك بشكل خاص حيث أظهرت الطفيليات التي تعبر عن جينات VAR التي تشفر PfEMP1 التي تحتوي على مجالات ربط EPCR ارتباطًا قويًا بتطور SM، بما في ذلك CM (Avril et al، 2012 ؛ Claessens et al، 2012 ؛ Lavstsen et al، 2012 ؛ Bengtsson et al، 2013 ؛ Bertin et al، 2013 ؛ Jespersen et al، 2016 ؛ Kessler et al، 2017 ؛ Mkumbaye et al، 2017). في المختبر، تُظهر الطفيليات التي تعبر عن PfEMP1 المرتبط بـ EPCR درجات أكبر من الارتباط بـ ePCR، وكذلك بمستقبلات ICAM -1، وكلاهما يتم التعبير عنه على البطانة الوعائية الدقيقة للدماغ (Turner et al، 2013 ؛ Avril et al، 2016 ؛ Lennartz et al، 2017). تم تعيين ربط ICAM -1 إلى بعض، ولكن ليس كل، نطاقات DBLβ الموجودة بجوار نطاقات CIDR الطرفية N في حوالي ثلث جميع PfEMP1. تبين مؤخرًا أن مجموعة فرعية من نطاقات DBLβ المرتبطة بـ ICAM -1 محددة للمجموعة A EPCR - binding PfEMP1 ووجد أنه يتم التعبير عنها عند مستويات أعلى في الطفيليات من مرضى CM مقارنة بالطفيليات من غير مرضى CM (Lennartz et al، 2017). تم العثور على الطفيليات التي تعبر عن PfEMP1 الملزم لـ CD36 في العديد من عزلات المرضى بغض النظر عن الأعراض، على الرغم من أن بعض البيانات تشير إلى أنها قد تشكل نسبة أقل من الطفيليات في مرضى SM (Heddini et al، 2001 ؛ Ndam et al، 2017)، ولا تظهر في عزلات الطفيليات المأخوذة من النساء المصابات بالملاريا المشيمية (Smith et al، 2013). ومع ذلك، تم وصف العديد من مستقبلات المضيف الأخرى لـ PfEMP1، في حين تم تحديد بروتينات PfEMP1 التي تربط هذه المستقبلات (Berger et al، 2013)، لم يتم إنشاء روابط بين الالتزام الخلوي و CM للأطفال، ولم يتم اختبارها في دراستنا. قد يكون لخلايا الدم الحمراء المصابة المرتبطة بمستقبلات محددة أثناء العدوى عواقب وظيفية مختلفة على البطانة وبالتالي على شدة المرض. أحد الأمثلة الواضحة على ذلك هو أنه من خلال الارتباط بـ ePCR، يتداخل IE مع إنتاج البروتين المنشط C وبالتالي إطلاق سلسلة التخثر، مما يؤدي إلى زيادة إنتاج الثرومبين (Moxon et al، 2013) وإمكانية التسبب في تنشيط بطاني مؤيد للالتهاب بوساطة PAR1 (Petersen et al، 2015 ؛ Gillrie et al، 2016). وقد ثبت أن تفاعلات مستقبلات PfEMP1 الأخرى تنشط مسارات الإشارات في الخلايا البطانية (Wu et al، 2011 ؛ Gillrie & Ho، 2017)، ولكن تأثير هذه الأحداث على علم الأمراض غير واضح. اقترح العمل الأحدث أيضًا أنه بالإضافة إلى الأحداث التي تتم بوساطة الالتزام الخلوي، فإن تراكم IE المعزول في الأوعية قد يسهل الخلل البطاني الناجم عن الإطلاق المحلي للوسطاء القابلين للذوبان بعد تمزق الفصام (Gallego - Delgado & Rodriguez، 2017). وبالتالي، لا يزال من غير الواضح سبب تطور CM لدى طفل معين في وقت معين، حيث أن الغالبية العظمى من عدوى P. falciparum لا تؤدي إلى CM. بالإضافة إلى ذلك، فإن معظم الأطفال الأفارقة الذين يصابون بالملاريا المزمنة قد أصيبوا بالملاريا سابقًا دون أن يصابوا بها. تتمثل إحدى الآليات الممكنة لشرح سبب تطور CM لدى الطفل في وقت معين في أنه قد أصيب بمتغير P. falciparum الذي يسهل تجنيد IE إلى البطانة في الدماغ. في حين تشير خطوط الأدلة المتعددة إلى أن متغيرات PfEMP1 المحددة مرتبطة بالملاريا الحادة، لم يتم إثبات هذا الارتباط من خلال القياس المباشر لربط IE بالخلايا البطانية (EC). وبالتالي، فإن مسألة ما إذا كان IE من الأطفال الذين يعانون من CM لديهم خصائص الالتصاق الخلوي التي تمكنهم من الارتباط بالبطانة الدماغية وبالتالي تعزيز عزلهم في هذا الموقع لم يتم اختبارها. إن مدى العزل في الدماغ غير معروف بالنسبة للحالات غير المرتبطة بالرنين المغناطيسي، على الرغم من أن ملاحظات ما بعد الوفاة للأوعية الدماغية من الأطفال المصابين بالملاريا الذين يموتون من أسباب أخرى للغيبوبة (وليس CM) تظهر مستويات أقل بكثير من عزل IE من حالات CM (Milner et al، 2015). لذلك، على سبيل المقارنة، تم أيضًا اختبار العزلات عن الأطفال المصابين بالملاريا غير المعقدة (UM) لنمطهم الظاهري الملزم في هذه الدراسة. قام عدد من الدراسات بالتحقيق في الارتباط الخلوي لمتغيرات PfEMP1 المحددة بالخلايا البطانية الوعائية الدقيقة البشرية، ولكن هذه كانت مع سلالات مختبرية أو طفيليات معدلة PfEMP1 (Madkhali et al، 2014 ؛ Gillrie et al، 2015). كما تم فحص عزلات المرضى لنمطها الظاهري الملزم، ولكن بشكل أساسي على البروتين المنقى ومعظمها في ظل ظروف ثابتة (Craig et al، 2012 ؛ Almelli et al، 2014 ؛ Mahamar et al، 2017 ؛ Ndam et al، 2017). مع تقديم أدلة مهمة، لم تتمكن هذه الدراسات، لأسباب فنية إلى حد كبير، من الجمع بين الهدف الأنسب (البطانة الدماغية الأولية) وعزل الطفيليات بالقرب من عينة المريض قدر الإمكان، مع اختبار ذي صلة من الناحية الفسيولوجية. لمعالجة فرضيتنا القائلة بأن CM مدفوع بزيادة ربط IE بالبطانة الدماغية، قمنا بتقييم ما إذا كان IE معزولًا حديثًا عن الدورة الدموية للأطفال المصابين بـ CM المرتبط بشكل تفضيلي بـ TNF - activated primary brain microvascular endothelium، مقارنة بـ IE معزول عن أطفال UM. لقد افترضنا أن مثل هذا الاختلاف قد يرتبط بالتعبير عن متغيرات PfEMP1 معينة وبالارتباط بمستقبلات بطانية محددة. جمعنا IE من حالات CM و UM للأطفال المميزة بعناية في ملاوي وحددنا الالتزام الخلوي بالخلايا البطانية الوعائية الدقيقة البشرية الأولية، مع الحد الأدنى من التوسع في المختبر لسكان الطفيليات، باستخدام جهاز تدفق السوائل الدقيقة، وهو تصميم تجريبي ينعكس في فسيولوجيا الجسم الحي. تم التحقيق في التعبير عن متغيرات PfEMP1 بواسطة qPCR باستخدام أحدث مجموعة من المواد التمهيدية الخاصة بنوع نطاق VAR المتاحة لنا. على حد علمنا، هذه الدراسة هي أول دراسة تستخدم مثل هذا النهج الشامل لمعالجة مسألة ما إذا كان الالتزام الخلوي متورطًا في التسبب في CM. النتائج تجنيد المشاركين في الدراسة تم تجنيد الأطفال على مدى ثلاثة مواسم للملاريا من 2013 إلى 2015 باستخدام معايير الاختيار الموضحة في قسم المواد والأساليب. انخفض إجمالي حالات CM التي تم قبولها في جناح البحث منذ عام 2010، من 165 حالة إلى 48 (18) حالة في عام 2013، و 78 (26) حالة في عام 2014 و 43 (14) حالة في عام 2015. الأرقام بين قوسين هي العدد المعين من الأطفال لدراسة الالتزام الخلوي لدينا. لتحسين خصوصية التشخيص السريري لـ CM، تم تضمين الأطفال الذين يعانون من سمة واحدة على الأقل من اعتلال الشبكية الملاريا (Maccormick et al، 2014) فقط، مما أدى إلى تجنيد ما مجموعه 58 حالة. تم تضمين ما مجموعه 53 حالة من حالات سوء التغذية الحاد، تتم مطابقتها على أساس سنوي مع عدد حالات سوء التغذية الحاد. يتم تلخيص الخصائص السريرية لمجموع مجموعات UM و CM والحالات المستخدمة للتجارب في الجدول 1. كان متوسط عمر الأطفال الذين يعانون من سوء التغذية الحاد أعلى من الأطفال الذين يعانون من سوء التغذية الحاد. بالمقارنة مع الأطفال الذين يعانون من UM، كان لدى الأطفال الذين يعانون من CM معدلات نبض وتنفس متوسطة أعلى بكثير، وتركيز لاكتات متوسط أعلى ومستويات هيماتوكريت متوسطة أقل، ومؤشرات للمرض الشديد (منظمة الصحة العالمية، 2016). توفي عشرة من الأطفال الذين يعانون من CM (17 ٪). لتحقيق 2 ٪ من الطفيليات اللازمة لفحوصات الالتزام الخلوي، تم استخدام عينات الدم فقط من الأطفال الذين يعانون من 2 ٪ على الأقل من الطفيليات الطرفية. كانت الخصائص السريرية لهذه الحالات المختارة مماثلة للمجموعة الإجمالية للأطفال الذين يعانون من كل من هذه المتلازمات السريرية. الجدول 1. الخصائص السريرية للمشاركين في الدراسة إجمالي مجموعة الملاريا غير المعقدة (n = 53) إجمالي مجموعة الملاريا الدماغية (n = 60) القيمة P المستخدمة في فحص الملاريا غير المعقدة (n = 35) المستخدمة في فحص الملاريا الدماغية (n = 27) عمر قيمة P، الأشهر 51 (30-74) 42 (24–59) 0.04 53 (38–89) 36 (23–50) 0.005 الجنس، ٪ أنثى 53 47 51 48 درجة حرارة الإبط، درجة مئوية 38.8 (38.2-39.4) 39.0 (38.1-40.0) 38.8 (381-39.4) 39.0 (37.9-40.0) معدل النبض، نبضات/دقيقة 124 (107–140) 157 (140–175) < 0.0001 124 (114-146) 156 (133-175) 0.0001 ضغط الدم الانقباضي، مم زئبق 98 (91–102) 95 (86–104)أ 97 (91–99) 94 (85–103)ب معدل التنفس، التنفس/دقيقة 30 (25–30) 40 (36–52) < 0.0001 28 (24–30) 41 (32–52) < 0.0001 نسبة السكر في الدم، ملي مول/لتر 5.7 (5.1–6.4) 5.4 (4.4-6.8) 5.8 (5.1-6.5) 5.0 (4.5-6.7) لاكتات الدم، ملي مول/لتر 2.9 (2.0–3.4) 4.5 (2.4-8.8) < 0.0001 2.9 (1.9–3.5) 4.6 (2.3–8.2) 0.0006 الهيماتوكريت، ٪ 35.0 (30.0-38.0) 22.0 (18.0-25.6) < 0.0001 36.0 (29.5-38.0) 20.4 (16.8-25.1) < 0.0001 HRP2، ميكروغرام/مل 7.1 (2.2-9.9)c 9.5 (3.1-11.0)d Parasitaemia، الطفيليات/ميكرو لتر (104) 11.8 (4.2-38.4) 29.8 (14.6–59.9) الصفائح الدموية/ميكرولتر (×104) 4.9 (2.4-9.6) c 4.9 (2.4-9.8)d يظهر الوسيط مع النطاق الربيعي بين قوسين لإجمالي الفوج والحالات المستخدمة في فحوصات الربط. بالنسبة لكل متغير، تم تحديد الاختلافات الإحصائية بين حالات UM و CM بواسطة اختبار U من Mann - Whitney (المتغيرات المستمرة) أو اختبار Fisher الدقيق (المتغيرات الفئوية)، ويتم الإشارة إلى قيم P < 0.05. HRP2 = بروتين غني بالهستيدين 2. حجم المجموعة في a = 50، b = 21، c = 55 و d = 24 طفلاً. تم استزراع الالتزام الخلوي للعزلات السريرية للخلايا البطانية الوعائية الدقيقة تحت تدفق IE المعزول حتى كانت الطفيليات في مرحلة التغذية التغذوية، عندما يتم التعبير عن PfEMP1 على سطح IE، وتم تحضير معلق من 2 ٪ من الطفيليات في الدم و 5 ٪ من الهيماتوكريت. باستخدام الجهاز السائل الدقيق، تم تحديد الالتزام الخلوي بالخلايا البطانية الوعائية الدقيقة البشرية الأولية، المستمدة من الدماغ (HBMEC) والأدمة (HDMEC)، في ظل ظروف التدفق. أظهرت العزلات من حالات CM ارتباطًا متوسطًا قدره 110 IE/mm2 (95 ٪ CI: 37–182) بـ HBMEC والذي كان أعلى بكثير (P = 0.041) من ربط HBMEC لحالات UM عند 43 IE/mm2 (95 ٪ CI: 28–57 ؛ الشكل 2). في المقابل، لم يكن هناك فرق في الارتباط بـ HDMEC (P = 0.171) بين IE من حالات CM (متوسط 165 IE/mm2، 95 ٪ CI: 81–250) وحالات UM (متوسط 110 IE/mm2، 95 ٪ CI: 71–149). كان ربط عزلات UM بـ HBMEC أقل بكثير مقارنة بـ HDMEC (P = 0.002)، وهو ما لم يكن عليه الحال بالنسبة لعزلات CM. بالنسبة للعزلات من مرضى CM، كان الربط المتعطش سمة شائعة ؛ كما أن العزلات المرتبطة جيدًا بـ HBMEC مرتبطة جيدًا بـ HDMEC مع معامل ارتباط Spearman البالغ 0.83 (P < 0.0001). ومع ذلك، بالنسبة لعزلات UM، لم يكن هناك ارتباط بين الارتباط بـ HBMEC و HDMEC (r = 0.20، P = 0.28). أظهر منشور حديث لـ Azasi et al (2018b) أن DC8 - PfEMP1 الذي يعبر عن IE لا يربط ePCR في وجود مصل بشري طبيعي. لذلك، اختبرنا ما إذا كانت إضافة 10 ٪ من مصل الدم البشري إلى العازل الملزم ستقلل من الالتصاق الخلوي لعزلات المريض المختارة إلى HBMEC (الملحق الشكل S2). لم يغير المصل البشري ربط ثلاث عزلات للمريض أظهرت ارتباطًا كبيرًا بـ EPCR لـ HBMEC. كما لم يتأثر ارتباط متغير DC8 IT4var19 بإضافة مصل بشري في نظام اختبار التدفق لدينا. الشكل 2. تم عزل الارتباط الخلوي لـ IE من حالات CM و UM إلى HBMEC و HDMECIE، وتم تحديد الارتباط بـ HBMEC و HDMEC في ظل ظروف التدفق. تم حساب عدد IE المرتبط بسطح EC مم 2 وعرضه هو متوسط ± 95 ٪ CI لـ 26 سم و 33 حالة UM على HBMEC و 21 سم و 35 حالة UM على HDMEC على مقياس لوغاريتمي. تم حساب قيمة P من خلال اختبار t غير المقترن ثنائي الذيل. الخط المنقط هو 20 IE/mm2، قيمة القطع لإدراج بيانات التثبيط. تنزيل الشكل تنزيل PowerPoint تثبيط الارتباط الخلوي بالخلايا البطانية الوعائية الدقيقة تحت التدفق لتقييم الدور التفاضلي للمستقبلات البطانية ICAM -1 و ePCR و CD36، تم تحديد الارتباط في وجود أجسام مضادة مثبطة، αICAM -1 و αCD 36، أو البروتين المؤتلف، rEPCR (الشكل 3). يظهر التحليل المقترن لبيانات ربط التثبيط في الشكل 3 أ ولوحظ تثبيط كبير لجميع مجموعات مثبطات EC، باستثناء تثبيط ربط عزلات UM بـ HDMEC بواسطة rEPCR. يتم تلخيص البيانات كنسبة مئوية من التثبيط في الشكل 3 ب- د، لمقارنة الالتصاق المعتمد على المستقبلات بين CM و UM. أظهر ما يقرب من نصف IE ارتباطًا معتمدًا على ICAM -1 (> تثبيط 50 ٪) لكل من HBMEC و HDMEC، ولكن لم يكن هناك فرق كبير بين عزلات CM و UM ولا بين اعتماد ICAM -1 المرتبط بـ HBMEC و HDMEC. تعبير CD36 منخفض للغاية على HBMEC الأساسي (Avril et al، 2016)، لذلك تم إجراء دراسات على الربط بـ CD36 فقط باستخدام HDMEC. كان تثبيط الالتزام الخلوي بواسطة الجسم المضاد αCD 36 متغيرًا ولا يختلف اختلافًا كبيرًا بين عزلات CM و UM (P = 0.23)، على الرغم من وجود اتجاه لارتباط أعلى يعتمد على CD36 في عزلات UM. يختلف الارتباط المعتمد على EPCR أيضًا، مع مجموعة فرعية من العزلات التي ترتبط بشكل جيد بشكل خاص بـ EPCR. كان هذا أكثر وضوحًا بالنسبة لعزلات CM المرتبطة بـ HBMEC، ولكن لا يختلف بشكل كبير عن عزلات UM (P = 0.073). لم يكن هناك أيضًا فرق كبير بين تثبيط rEPCR للارتباط بـ HBMEC و HDMEC. بالنسبة لبعض العزلات، كان هناك ربط أكثر في وجود الجسم المضاد αICAM -1 أو rEPCR مقارنة بالربط في حالة عدم وجود مثبط (الشكل 3 ب و د)، وكان هذا هو الحال في كثير من الأحيان بالنسبة لعزلات UM. والسبب في ذلك غير واضح ؛ لم نتمكن من جمع المعلومات الملزمة لإجراء مزيد من التحقيق في هذه الظاهرة. الشكل 3. تم عزل تثبيط الالتصاق الخلوي لـ IE من حالات CM و UM إلى HDMEC و HBMEC بواسطة αICAM -1 و αCD 36 الأجسام المضادة و rEPCR † A. IE، وتم تحديد الارتباط بـ HBMEC و HDMEC في ظل ظروف التدفق في غياب ووجود 5 ميكروغرام/مل من αICAM -1 أو αCD 36 الأجسام المضادة أو 50 ميكروغرام/مل من rEPCR. تم تحديد عدد IE المرتبط بسطح EC مم 2. ب. باستخدام نفس البيانات، تم حساب النسبة المئوية للتثبيط بواسطة الجسم المضاد αICAM -1 نسبيًا للربط في حالة عدم وجود جسم مضاد. ج. باستخدام نفس البيانات، تم حساب النسبة المئوية للتثبيط بواسطة rEPCR نسبيًا إلى الربط في حالة عدم وجود مثبط. د. باستخدام نفس البيانات، تم حساب النسبة المئوية للتثبيط بواسطة الجسم المضاد αCD 36 نسبيًا للارتباط في حالة عدم وجود جسم مضاد. معلومات البيانات: (أ) الموضحة هي التحليل المقترن بين غياب المثبط ووجوده، مع الإشارة إلى عدد الحالات (ن). تم تحديد الأهمية الإحصائية من خلال اختبار t المقترن ثنائي الذيل، ويتم عرض قيمة P ؛ ns ليست مهمة. (B - D) الموضحة هي متوسط ± 95 ٪ CI، ولم يتم تحديد أي فروق ذات دلالة إحصائية مع اختبار t غير المقترن ثنائي الذيل. تم إجراء كل اختبار مرة واحدة فقط لكل عزل. يمكن رؤية عدد العزلات التي تم اختبارها من مخطط النقاط. رقم التنزيل قم بتنزيل ارتباطات PowerPoint بين ربط IE والمعلمات السريرية قمنا بتقييم الارتباط بين خصائص الالتزام الخلوي في المختبر لـ IE والمعلمات السريرية المرتبطة بالعزل. بالنسبة لحالات CM، كانت درجة ارتباط IE بـ HDMEC مرتبطة بشكل إيجابي بكثافة الطفيليات الطرفية عند التوظيف (r = 0.56، P = 0.011). كان ربط IE بـ HBMEC أقل ارتباطًا بوضوح بكثافة الطفيليات الطرفية (r = 0.40، P = 0.056). لم تكن الاختلافات في مستويات الربط ناتجة عن التباين في طفيليات الدم في IE المستزرعة، حيث تم إجراء اختبار الربط عند طفيليات قياسية بنسبة 2 ٪. كان ربط عزلات CM مرتبطًا سلبًا بمستويات الصفائح الدموية الطرفية لكل من الارتباط بـ HDMEC (r = −0.66، P = 0.001) و HBMEC (r = −0.56، P = 0.005). لم نتمكن من تقييم الارتباط بين التصاق IE والنتيجة المميتة حيث توفي ثلاثة أطفال فقط كان لدينا بيانات ملزمة لهم. لم تظهر أي من الخصائص السريرية الأخرى، بما في ذلك تركيزات البروتين 2 الغني بالهستيدين، أي ارتباط كبير مع الالتصاق الخلوي لـ IE. بالنسبة لحالات UM، لم تكن أي من المعلمات التي تم تقييمها مرتبطة بشكل كبير بالالتزام الخلوي. لم يتم تحديد كثافة الطفيليات الطرفية (وفقًا لمعيار منظمة الصحة العالمية) وعدد الصفائح الدموية عند القبول في حالات UM ؛ ومع ذلك، بعد معالجة عينات دم UM، تم تحديد الطفيليات عن طريق الفحص المجهري لمسحات Giemsa الملطخة ولم يتم العثور على أي ارتباط بين الطفيليات وشدة الارتباط. تحليل نصوص جينات VAR لتحليل بنية مجال PfEMP1 (الشكل 1) لعزل المريض، تم تحديد مستويات نصوص جينات VAR المشفرة. تم إجراء qPCR وتم حساب قيم نصوص VAR (Tu) ومقارنتها بين حالات CM و UM (الجدول 2). وصف تفصيلي للتغطية والحساسية والحدود<br/>Rapport4 janvier 2019Open Access Transparent process Cerebral malaria is associated with differential cytoadherence to brain endothelial cells Janet Storm Corresponding Author Janet Storm [email protected] orcid.org/0000-0001-7812-4220 Department of Parasitology, Liverpool School of Tropical Medicine, Liverpool, UK Malawi-Liverpool-Wellcome Trust Clinical Research Programme, Blantyre, Malawi College of Medicine, University of Malawi, Blantyre, Malawi Search for more papers by this author Jakob S Jespersen Jakob S Jespersen orcid.org/0000-0002-4930-5900 Department of International Health, Immunology & Microbiology, Centre for Medical Parasitology, University of Copenhagen, Copenhagen, Denmark Department of Infectious Diseases, Rigshospitalet, Copenhague, Danemark Rechercher d'autres articles de cet auteur Karl B Seydel Karl B Seydel College of Medicine, University of Malawi, Blantyre, Malawi Blantyre Malaria Project, College of Medicine, University of Malawi, Blantyre, Malawi Department of Osteopathic Medical Specialties, College of Osteopathic Medicine, Michigan State University, East Lansing, MI, USA Rechercher d'autres articles de cet auteur Tadge Szestak Tadge Szestak Department of Parasitology, Liverpool School of Tropical Medicine, Liverpool, UK Rechercher d'autres articles de cet auteur Maurice Mbewe Maurice Mbewe Malawi-Liverpool-Wellcome Trust Clinical Research Programme, Blantyre, Malawi Rechercher d'autres articles de cet auteur Ngawina V Chisala Ngawina V Chisala Malawi-Liverpool-Wellcome Trust Clinical Research Programme, Blantyre, Malawi Rechercher d'autres articles de cet auteur Patricia Phula Patricia Phula Malawi-Liverpool-Wellcome Trust Clinical Research Programme, Blantyre, Malawi Rechercher d'autres articles de cet auteur Christian W Wang Christian W Wang Department of International Health, Immunology & Microbiology, Centre for Medical Parasitology, University of Copenhagen, Copenhagen, Denmark Department of Infectious Diseases, Rigshospitalet, Copenhagen, Denmark Rechercher d'autres articles de cet auteur Terrie E Taylor Terrie E Taylor Blantyre Malaria Project, College of Medicine, University of Malawi, Blantyre, Malawi Department of Osteopathic Medical Specialties, College of Osteopathic Medicine, Michigan State University, East Lansing, MI, USA Rechercher d'autres articles par cet auteur Christopher A Moxon Christopher A Moxon Institute of Infection and Global Health, University of Liverpool, Liverpool, UK Wellcome Centre for Molecular Parasitology, Institute of Infection, Immunity and Inflammation, College of Medical Veterinary & Life Sciences, University of Glasgow, Glasgow, UK Rechercher d'autres articles par cet auteur Thomas Lavstsen Thomas Lavstsen orcid.org/0000-0002-3044-4249 Department of International Health, Immunology & Microbiology, Centre for Medical Parasitology, University of Copenhagen, Copenhagen, Denmark Department of Infectious Diseases, Rigshospitalet, Copenhagen, Denmark Search for more papers by this author Alister G Craig Corresponding Author Alister G Craig [email protected] orcid.org/0000-0003-0914-6164 Department of Parasitology, Liverpool School of Tropical Medicine, Liverpool, UK Search for more papers by this author Janet Storm Corresponding Author Janet Storm [email protected] orcid.org/0000-0001-7812-4220 Department of Parasitology, Liverpool School of Tropical Medicine, Liverpool, UK Malawi-Liverpool-Wellcome Trust Clinical Research Programme, Blantyre, Malawi College of Medicine, University of Malawi, Blantyre, Malawi Rechercher d'autres articles de cet auteur Jakob S Jespersen Jakob S Jespersen orcid.org/0000-0002-4930-5900 Department of International Health, Immunology & Microbiology, Centre for Medical Parasitology, University of Copenhagen, Copenhagen, Denmark Department of Infectious Diseases, Rigshospitalet, Copenhagen, Denmark Rechercher d'autres articles de cet auteur Karl B Seydel Karl B Seydel College of Medicine, University of Malawi, Blantyre, Malawi Blantyre Malaria Project, College of Medicine, University of Malawi, Blantyre, Malawi Department of Osteopathic Medical Specialties, College of Osteopathic Medicine, Michigan State University, East Lansing, MI, USA Rechercher d'autres articles de cet auteur Tadge Szestak Tadge Szestak Department of Parasitology, Liverpool School of Tropical Medicine, Liverpool, UK Rechercher d'autres articles de cet auteur Maurice Mbewe Maurice Mbewe Malawi-Liverpool-Wellcome Trust Clinical Research Programme, Blantyre, Malawi Rechercher d'autres articles de cet auteur Ngawina V Chisala Ngawina V Chisala Malawi-Liverpool-Wellcome Trust Clinical Research Programme, Blantyre, Malawi Rechercher d'autres articles de cet auteur Patricia Phula Patricia Phula Malawi-Liverpool-Wellcome Trust Clinical Research Programme, Blantyre, Malawi Rechercher d'autres articles de cet auteur Christian W Wang Christian W Wang Department of International Health, Immunology & Microbiology, Centre for Medical Parasitology, University of Copenhagen, Copenhagen, Denmark Department of Infectious Diseases, Rigshospitalet, Copenhagen, Denmark Rechercher d'autres articles de cet auteur Terrie E Taylor Terrie E Taylor Blantyre Malaria Project, College of Medicine, University of Malawi, Blantyre, Malawi Department of Osteopathic Medical Specialties, College of Osteopathic Medicine, Michigan State University, East Lansing, MI, USA Rechercher d'autres articles de cet auteur Christopher A Moxon Christopher A Moxon Institute of Infection and Global Health, University of Liverpool, Liverpool, UK Wellcome Centre for Molecular Parasitology, Institute of Infection, Immunity and Inflammation, College of Medical Veterinary & Life Sciences, University of Glasgow, Glasgow, UK Rechercher d'autres articles par cet auteur Thomas Lavstsen Thomas Lavstsen orcid.org/0000-0002-3044-4249 Department of International Health, Immunology & Microbiology, Centre for Medical Parasitology, University of Copenhagen, Copenhagen, Denmark Department of Infectious Diseases, Rigshospitalet, Copenhagen, Denmark Rechercher d'autres articles par cet auteur Alister G Craig Corresponding Author Alister G Craig [email protected] orcid.org/0000-0003-0914-6164 Department of Parasitologie, Liverpool School of Tropical Medicine, Liverpool, Royaume-Uni Rechercher d'autres articles de cet auteur Informations sur l'auteur Janet Storm *,1,2,3, Jakob S Jespersen4,5, Karl B Seydel3,6,7, Tadge Szestak1, Maurice Mbewe2, Ngawina V Chisala2, Patricia Phula2, Christian W Wang4,5, Terrie E Taylor6,7, Christopher A Moxon8,9, Thomas Lavstsen4,5 et Alister G Craig *,1 1Département de Parasitologie, Liverpool School of Tropical Medicine, Liverpool, Royaume-Uni 2Malawi-Liverpool-Wellcome Trust Clinical Research Programme, Blantyre, Malawi 3College of Medicine, University of Malawi, Blantyre, Malawi 4Département de Santé Internationale, Immunologie et Microbiologie, Centre for Medical Parasitology, University of Copenhagen, Copenhagen, Denmark 5Department of Infectious Diseases, Rigshospitalet, Copenhagen, Denmark 6Blantyre Malaria Project, College of Medicine, University of Malawi, Blantyre, Malawi 7Department of Osteopathic Medical Specialties, College of Osteopathic Medicine, Michigan State University, East Lansing, MI, USA 8Institute of Infection and Global Health, University of Liverpool, Liverpool, UK 9Wellcome Centre for Molecular Parasitology, Institute of Infection, Immunity and Inflammation, College of Medical Veterinary & Life Sciences, University of Glasgow, Glasgow, UK *Auteur correspondant. Tél : +44 151 705 3297 ; E-mail : [email protected] *Auteur correspondant. Tél : +44 151 705 3161 ; E-mail : [email protected] EMBO Mol Med (2019)11 : e9164https://doi.org/10.15252/emmm.201809164 PDFTélécharger PDF du texte de l'article et des figures principales. Examen par les pairsTéléchargez un résumé du processus de décision éditoriale, y compris les lettres de décision éditoriale, les commentaires des évaluateurs et les réponses des auteurs aux commentaires. ToolsAdd to favoritesDownload CitationsTrack CitationsPermissions ShareFacebookTwitterLinked InMendeleyWechatReddit Figures & Info Abstract Sequestration of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes (IE) within the brain microvasculature is a markmark of cerebral malaria (CM). À l'aide d'un test d'adhésion par flux de microcanaux avec des cellules endothéliales microvasculaires humaines primaires activées par le TNF, nous démontrons que les EI isolés à partir de cas de CM pédiatriques malawiens ont montré une liaison accrue aux cellules endothéliales microvasculaires cérébrales par rapport aux EI provenant de cas de paludisme non compliqué (MU). De plus, les isolats d'UM ont montré une adhérence significativement plus grande aux cellules endothéliales dermiques qu'aux cellules endothéliales microvasculaires du cerveau. Le principal médiateur de l'adhésion parasitaire est la protéine membranaire 1 des érythrocytes de P. falciparum, codée par les gènes VAR. Des niveaux plus élevés de transcrits du gène VAR prédits pour se lier au récepteur de la protéine C endothéliale de l'hôte (EPCR) et à l'ICAM-1 ont été détectés dans les isolats de CM. Ces données fournissent des preuves supplémentaires de la liaison tissulaire différentielle dans les syndromes du paludisme graves et non compliqués, et apportent un soutien supplémentaire à l'hypothèse selon laquelle la pathologie de la MC est basée sur une cytoadhérence accrue de l'EI dans la microvascularisation cérébrale. Synopsis La cytoadhérence des érythrocytes infectés par Plasmodium falciparum (IE) aux cellules endothéliales tapissant les vaisseaux cérébraux est une caractéristique du paludisme cérébral (CM). Cette étude montre que la capacité de l'IE à cytoadhere dans le cerveau des patients atteints de MC et de paludisme non compliqué est associée à la maladie. Les EI des enfants atteints de paludisme non compliqué ne se lient pas bien aux cellules endothéliales cérébrales, tandis que les EI des patients atteints de CM montrent des niveaux élevés de liaison. Des associations significatives dans la liaison de l'IE aux cellules endothéliales cérébrales ont été observées à la fois pour l'ICAM-1 et L'EPCR. Des variants de PfEMP1 contenant des motifs de liaison à l'EPCR ont été associés au paludisme cérébral. Introduction Malgré les réductions significatives de la mortalité et de la morbidité du paludisme au cours de la dernière décennie, le pourcentage de patients infectés par Plasmodium falciparum QUI succombent au paludisme grave (SM) ne change pas (OMS, 2017), le paludisme cérébral (CM) contribuant à une grande partie de la mortalité. Le taux de mortalité global de la MC chez les enfants est de 15 à 25 %, une étude IRM récente montrant que le gonflement du cerveau est fortement associé à une issue fatale de la MC (Seydel et al, 2015). La pathologie de la MC a été largement étudiée (Idro et al, 2005 ; Hawkes et al, 2013) mais aussi débattue pendant de nombreuses décennies, comme discuté dans de nombreuses revues (Shikani et al, 2012 ; Cunnington et al, 2013 ; Storm & Craig, 2014 ; Wassmer & Grau, 2017). Ce qui est clair, c'est que la pathogenèse est multifactorielle, avec un rôle pour la réponse immunitaire à l'infection à Plasmodium (Hunt & Grau, 2003 ; Ioannidis et al, 2014 ; Dieye et al, 2016 ; Mandala et al, 2017 ; Wolf et al, 2017) et l'obstruction de la microvasculature par séquestration et roset (Rowe et al, 2009 ; Craig et al, 2012 ; Ponsford et al, 2012 ; White et al, 2013 ; Milner et al, 2015), conduisant à un dysfonctionnement endothélial. La séquestration des érythrocytes (EI) infectés par P. falciparum dans la microvascularisation cérébrale est une caractéristique de la MC humaine comme le montrent les études post-mortem (Pongponratn et al, 1991 ; Taylor et al, 2004), mais il a été plus difficile de démontrer si cette séquestration est due à une liaison différentielle de l'EI à l'endothélium cérébral. Le principal médiateur de la cytoadhérence du parasite à l'endothélium est la protéine membranaire 1 de l'érythrocyte de P. falciparum (PfEMP1), un antigène de surface variant exprimé sur les boutons à la surface de l'IE et codé par environ 60 gènes var par génome de parasite, un seul PfEMP1 étant exprimé à la surface de tout IE individuel (Scherf et al, 2008 ; Pasternak & Dzikowski, 2009). PfEMP1 est composé de plusieurs domaines de type liaison de Duffy (DBL) et de région interdomaine riche en cystéine (CIDR) et peut être classé en quatre groupes principaux A, B, C et E en fonction de la séquence amont 5′ du gène VAR codant (Fig 1 ; Smith, 2014). PfEMP1 se lie à une gamme de récepteurs et comprend les phénotypes mutuellement exclusifs de liaison au récepteur CD36 et au récepteur endothélial de la protéine C (EPCR), médiés par les domaines CIDR N-terminaux (Kraemer & Smith, 2006 ; Semblat et al, 2006, 2015 ; Rask et al, 2010 ; Hviid & Jensen, 2015). Environ la moitié des PfEMP1 du groupe A et un sous-ensemble de PfEMP1 chimérique du groupe B/A, également connu sous le nom de cassette de domaine 8 (DC8), se lient à l'EPCR VIA les domaines CIDRα1, tandis que les PfEMP1 des groupes B et C se lient à CD36 via les domaines CIDRα2-CIDRα6. De plus, la liaison à la molécule d'adhésion intercellulaire 1 (ICAM-1) est médiée par des domaines DBLβ adjacents aux domaines CIDR et, dans certains cas, a été associée à un phénotype à double liaison avec L'EPCR (Lennartz et al, 2017). Figure 1. Structure du domaine PfEMP1 Une présentation schématique de la structure du domaine PfEMP1 comprenant une structure de tête N-terminale, 2-6 domaines C-terminaux ultérieurs, un domaine transmembranaire (TM) et un segment terminal acide intracellulaire (ATS) avec des récepteurs connus indiqués en gras. La spécificité des récepteurs est déterminée par la combinaison des domaines Dbl et CIDR avec une liaison mutuellement exclusive à L'EPCR et au CD36 par différents domaines CIDRα dans la structure de tête. Une partie du groupe A PfEMP1 et un sous-ensemble particulier du groupe B/A chimérique PfEMP1 (DC8) se lient à l'EPCR via LES domaines CIDRα1, tandis que les groupes B et C PfEMP1 se lient à CD36 via les domaines CIDRα2-6. Le groupe E atypique VAR2CSA PfEMP1 se lie au sulfate de chondroïtine placentaire A (CSA) via les domaines DBLpam1 et DBLpam2. Le phénotype de liaison des domaines VAR1, VAR3 et CIDRβ/γ/δ du groupe A est inconnu, mais ils ne se lient pas à l'EPCR ou au CD36. Les domaines DBLβ peuvent être impliqués dans la liaison à l'ICAM-1 et proviennent à la fois des groupes A et B. On en sait peu sur les autres domaines DBL (γ/δ/ε/ζ), mais les domaines DBLε et DBLζ sont impliqués dans la liaison aux IgM et à l'α2-macroglobuline. Télécharger la figure Télécharger PowerPoint En choisissant les récepteurs hôtes à étudier, nous avons pris en compte les résultats selon lesquels les catégories de types PfEMP1 sont également associées à l'expression in vivo dans le SM. Un exemple particulièrement fort est celui des parasites exprimant des gènes VAR codant pour PfEMP1 contenant des domaines de liaison EPCR qui ont montré une forte association avec le développement de SM, y compris CM (Avril et al, 2012 ; Claessens et al, 2012 ; Lavstsen et al, 2012 ; Bengtsson et al, 2013 ; Bertin et al, 2013 ; Jespersen et al, 2016 ; Kessler et al, 2017 ; Mkumbaye et al, 2017). In vitro, les parasites exprimant la PfEMP1 se liant à l'EPCR montrent des degrés de liaison plus élevés à l'EPCR, ainsi qu'aux récepteurs ICAM-1, qui sont tous deux exprimés sur l'endothélium microvasculaire cérébral (Turner et al, 2013 ; Avril et al, 2016 ; Lennartz et al, 2017). La liaison ICAM-1 a été mappée à certains, mais pas à tous, domaines DBLβ adjacents aux domaines CIDR N-terminaux dans environ un tiers de tous les PfEMP1. Un sous-ensemble de domaines DBLβ de liaison à l'ICAM-1 s'est récemment avéré spécifique de la PfEMP1 de liaison à l'EPCR du groupe A et s'est révélé exprimé à des niveaux plus élevés chez les parasites des patients atteints de MC que chez les parasites des patients non atteints de MC (Lennartz et al, 2017). Les parasites exprimant la PfEMP1 se liant à CD36 se trouvent dans de nombreux isolats de patients indépendamment des symptômes, bien que certaines données suggèrent qu'ils peuvent constituer une plus faible proportion de parasites chez les patients atteints de SM (Heddini et al, 2001 ; Ndam et al, 2017), et ne sont pas observés dans les isolats de parasites prélevés chez les femmes atteintes de paludisme placentaire (Smith et al, 2013). Plusieurs autres récepteurs hôtes de PfEMP1 ont été décrits, cependant, alors que les protéines PfEMP1 qui se lient à ces récepteurs ont été identifiées (Berger et al, 2013), les liens entre la cytoadhérence et la CM pédiatrique n'ont pas été établis, et ceux-ci n'ont pas été testés dans notre étude. Les érythrocytes infectés se liant à des récepteurs spécifiques au cours d'une infection peuvent avoir des conséquences fonctionnelles différentes sur l'endothélium et donc sur la gravité de la maladie. Un exemple clair est qu'en se liant à l'EPCR, l'IE interfère avec la production de protéine C activée, lançant ainsi la cascade de coagulation, entraînant une augmentation de la production de thrombine (Moxon et al, 2013) et le potentiel de provoquer une activation endothéliale pro-inflammatoire médiée par PAR1 (Petersen et al, 2015 ; Gillrie et al, 2016). D'autres interactions PfEMP1-récepteur ont été montrées pour activer les voies de signalisation dans les cellules endothéliales (Wu et al, 2011 ; Gillrie & Ho, 2017), mais l'effet de ces événements sur la pathologie n'est pas clair. Des travaux plus récents ont également suggéré qu'en plus des événements médiés par la cytoadhérence, l'accumulation d'EI séquestrés dans les vaisseaux peut faciliter le dysfonctionnement endothélial causé par la libération locale de médiateurs solubles après la rupture du schizont (Gallego-Delgado & Rodriguez, 2017). Ainsi, on ne sait toujours pas pourquoi un enfant en particulier développe la MC à un moment donné, car la grande majorité des infections à P. falciparum ne conduisent pas à la MC. En outre, la plupart des enfants africains qui développent une MC ont déjà eu le paludisme sans développer de MC. Un mécanisme possible pour expliquer pourquoi un enfant développe une MC à un moment donné est qu'il a été infecté par une variante de P. falciparum qui facilite le recrutement de l'EI dans l'endothélium cérébral. Bien que plusieurs sources de données indiquent que des variants spécifiques de PfEMP1 sont associés à un paludisme grave, cette association n'a pas été prouvée en mesurant directement la liaison de l'EI aux cellules endothéliales (CE). Ainsi, la question de savoir si les EI des enfants atteints de CM ont des propriétés de cytoadhérence qui leur permettent de se lier à l'endothélium cérébral et donc d'améliorer leur séquestration dans ce site n'a pas été testée. L'étendue de la séquestration dans le cerveau est inconnue pour les cas non CM, bien que les observations post-mortem de vaisseaux cérébraux d'enfants infectés par le paludisme mourant d'autres causes de coma (pas de CM) montrent des niveaux beaucoup plus faibles de séquestration de l'EI que les cas de CM (Milner et al, 2015). Par conséquent, à titre de comparaison, les isolats d'enfants atteints de paludisme non compliqué (MU) ont également été testés pour leur phénotype de liaison dans la présente étude. Un certain nombre d'études ont étudié la cytoadhérence de variants spécifiques de PfEMP1 aux cellules endothéliales microvasculaires humaines, mais celles-ci ont été réalisées avec des souches de laboratoire ou des parasites modifiés par PfEMP1 (Madkhali et al, 2014 ; Gillrie et al, 2015). Des isolats de patients ont également été étudiés pour leur phénotype de liaison, mais principalement sur des protéines purifiées et principalement dans des conditions statiques (Craig et al, 2012 ; Almelli et al, 2014 ; Mahamar et al, 2017 ; Ndam et al, 2017). Tout en fournissant des preuves importantes, ces études ont été incapables, en grande partie pour des raisons techniques, de combiner la cible la plus appropriée (endothélium cérébral primaire) et les isolats de parasites aussi près que possible de l'échantillon du patient, avec un dosage physiologiquement pertinent. Pour répondre à notre hypothèse selon laquelle la CM est entraînée par une liaison accrue de l'IE à l'endothélium cérébral, nous avons évalué si l'IE fraîchement isolée du sang circulant d'enfants atteints d'endothélium microvasculaire cérébral primaire activé par le TNF lié préférentiellement à la CM, par rapport à l'IE isolée chez les enfants atteints de MU. Nous avons postulé qu'une telle différence pourrait être associée à l'expression de variants particuliers de PfEMP1 et à la liaison à des récepteurs endothéliaux spécifiques. Nous avons collecté des EI à partir de cas de CM et de MU pédiatriques soigneusement caractérisés au Malawi et déterminé la cytoadhérence aux cellules endothéliales microvasculaires humaines primaires, avec une expansion in vitro minimale de la population parasitaire, à l'aide d'un dispositif d'écoulement microfluidique, un modèle expérimental reflétant la physiologie in vivo. L'expression des variants de PfEMP1 a été étudiée par qPCR en utilisant l'ensemble le plus à jour d'amorces spécifiques au type de domaine var à notre disposition. À notre connaissance, cette étude est la première à utiliser une approche aussi complète pour répondre à la question de savoir si la cytoadhérence est impliquée dans la pathogenèse de la MC. Résultats Recrutement des participants à l'étude Les enfants ont été recrutés sur trois saisons de paludisme de 2013 à 2015 en utilisant les critères de sélection décrits dans la section Matériels et méthodes. Le nombre total de cas de MC admis dans le service de recherche a diminué depuis 2010, passant de 165 cas à 48 (18) cas en 2013, 78 (26) en 2014 et 43 (14) en 2015. Les chiffres entre parenthèses sont le nombre d'enfants recrutés pour notre étude de cytoadhérence. Pour améliorer la spécificité du diagnostic clinique de la MC, seuls les enfants présentant au moins une caractéristique de rétinopathie paludéenne (Maccormick et al, 2014) ont été inclus, ce qui a entraîné le recrutement d'un total de 58 cas. Un total de 53 cas de MU, appariés sur une base annuelle au nombre de cas de MC, ont été inclus. Les caractéristiques cliniques des cohortes UM et CM totales et les cas utilisés pour les expériences sont résumés dans le tableau 1. L'âge médian des enfants atteints de MU était plus élevé que celui des enfants atteints de MC. Par rapport aux enfants atteints de MU, les enfants atteints de MC présentaient des taux médians de pouls et de respiration significativement plus élevés, une concentration médiane de lactate plus élevée et des taux médians d'hématocrite plus faibles, indicateurs de maladie grave (OMS, 2016). Dix des enfants atteints de CM (17 %) sont décédés. Pour atteindre 2% de parasitémie nécessaire pour les tests de cytoadhérence, seuls des échantillons de sang d'enfants présentant une parasitémie périphérique d'au moins 2% ont été utilisés. Les caractéristiques cliniques de ces cas sélectionnés étaient similaires à celles de la cohorte globale d'enfants atteints de chacun de ces syndromes cliniques. Tableau 1. Caractéristiques cliniques des participants à l'étude Paludisme non compliqué de la cohorte totale (n = 53) Paludisme cérébral de la cohorte totale (n = 60) Valeur de P utilisée dans le test Paludisme non compliqué (n = 35) Utilisée dans le test Paludisme cérébral (n = 27) Valeur de P Âge, mois 51 (30–74) 42 (24–59) 0,04 53 (38–89) 36 (23–50) 0,005 Sexe, % de femmes 53 47 51 48 Température axillaire, °C 38,8 (38,2-39,4) 39,0 (38,1-40,0) 38,8 (381-39,4) 39,0 (37,9-40,0) Fréquence cardiaque, battements/min 124 (107–140) 157 (140–175) < 0,0001 124 (114-146) 156 (133–175) 0,0001 Pression artérielle systolique, mmHg 98 (91–102) 95 (86–104)a 97 (91–99) 94 (85–103)b Fréquence respiratoire, respirations/min 30 (25–30) 40 (36–52) < 0,0001 28 (24–30) 41 (32–52) < 0,0001 Glycémie, mmol/l 5,7 (5,1-6,4) 5,4 (4,4-6,8) 5,8 (5,1-6,5) 5,0 (4,5-6,7) Lactate sanguin, mmol/l 2,9 (2,0-3,4) 4,5 (2,4-8,8) < 0,0001 2,9 (1,9-3,5) 4,6 (2,3-8,2) 0,0006 Hématocrite, % 35,0 (30,0-38,0) 22,0 (18,0-25,6) < 0,0001 36,0 (29,5-38,0) 20,4 (16,8-25,1) < 0,0001 HRP2, μg/ml 7,1 (2,2-9,9)c 9,5 (3,1-11,0)d Parasitémie, parasites/μl (×104) 11,8 (4,2-38,4) 29,8 (14,6-59,9) Plaquettes/μl (×104) 4,9 (2,4-9,6)c 4,9 (2,4-9,8)d Les valeurs indiquées sont la médiane avec l'intervalle interquartile entre parenthèses pour la cohorte totale et les cas utilisés dans les essais de liaison. Pour chaque variable, les différences statistiques entre les cas de MU et de CM ont été déterminées par le test U de Mann–Whitney (variables continues) ou le test exact de Fisher (variables catégorielles), et les valeurs de P < 0,05 sont indiquées. HRP2 = protéine riche en histidine 2. Taille du groupe chez a = 50, b = 21, c = 55 et d = 24 enfants. Cytoadherence of clinical isolates to microvascular endothelial cells under flow Isolated IE were cultived until the parasites were at the trophozoite stage, when PfEMP1 is expressed on the surface of the IE, and a suspension of 2% parasitaemia and 5% haematocrit was prepared. À l'aide du dispositif microfluidique, la cytoadhérence aux cellules endothéliales microvasculaires humaines primaires, dérivées du cerveau (HBMEC) et du derme (HDMEC), a été déterminée dans des conditions d'écoulement. Les isolats des cas de CM ont démontré une liaison moyenne de 110 IE/mm2 (IC à 95 % : 37-182) à l'HBMEC, ce qui était significativement plus élevé (P = 0,041) que la liaison à l'HBMEC des cas d'UM à 43 IE/mm2 (IC à 95 % : 28–57 ; Fig 2). En revanche, il n'y avait pas de différence de liaison à l'HDMEC (P = 0,171) entre l'EI des cas de CM (moyenne 165 EI/mm2, IC à 95 % : 81–250) et les cas d'UM (moyenne 110 EI/mm2, IC à 95 % : 71–149). La liaison des isolats d'UM à l'HBMEC était significativement plus faible par rapport à l'HDMEC (P = 0,002), ce qui n'était pas le cas pour les isolats de CM. Pour les isolats provenant de patients atteints de MC, la liaison avide était une caractéristique commune ; les isolats qui se sont bien liés à HBMEC se sont également bien liés à HDMEC avec un coefficient de corrélation de Spearman de 0,83 (P < 0,0001). Pour les isolats d'UM, cependant, il n'y avait pas de corrélation entre la liaison à l'HBMEC et à l'HDMEC (r = 0,20, P = 0,28). Une publication récente d'Azasi et al (2018b) a montré que DC8-PfEMP1 exprimant l'IE ne se lie pas À l'EPCR en présence de sérum humain normal. Par conséquent, nous avons testé si l'ajout de 10% de sérum humain au tampon de liaison diminuerait la cytoadhérence des isolats de patients sélectionnés à HBMEC (Annexe Fig S2). Le sérum humain n'a pas modifié la liaison de trois isolats de patients qui ont montré une liaison significative DE l'EPCR à l'HBMEC. La liaison du variant DC8 IT4var19 n'a pas non plus été affectée par l'ajout de sérum humain dans notre système de dosage en flux. Figure 2. La cytoadhérence de l'EI des cas de CM et d'UM à HBMEC et HDMECIE a été isolée, et la liaison à HBMEC et HDMEC a été déterminée dans des conditions d'écoulement. Le nombre d'EI liés par mm2 de surface EC a été calculé et montré est l'IC moyen ± 95% pour 26 cas CM et 33 cas UM sur HBMEC et 21 cas CM et 35 cas UM sur HDMEC sur une échelle logarithmique. La valeur de p a été calculée par test t bilatéral non apparié. La ligne pointillée est de 20 IE/mm2, la valeur seuil pour l'inclusion des données d'inhibition. Télécharger la figure Télécharger PowerPoint Inhibition de la cytoadhérence aux cellules endothéliales microvasculaires sous flux Pour évaluer le rôle différentiel des récepteurs endothéliaux ICAM-1, EPCR et CD36, la liaison a été déterminée en présence d'anticorps inhibiteurs, αICAM-1 et αCD36, ou de protéine recombinante, rEPCR (Fig 3). L'analyse appariée des données de liaison à l'inhibition est illustrée à la figure 3A et une inhibition significative a été observée pour toutes les combinaisons d'inhibiteurs de la CE, à l'exception de l'inhibition de la liaison des isolats d'UM à l'HDMEC par rEPCR. Les données sont résumées en pourcentage d'inhibition dans la figure 3B-D, pour comparer l'adhérence dépendante des récepteurs entre la CM et l'UM. Environ la moitié de l'EI présentait une liaison ICAM-1-dépendante (inhibition > 50 %) à la fois à l'HBMEC et à l'HDMEC, mais il n'y avait pas de différence significative entre les isolats CM et UM ni entre la dépendance de la liaison ICAM-1 à l'HBMEC et à l'HDMEC. L'expression de CD36 est extrêmement faible sur HBMEC primaire (Avril et al, 2016), de sorte que les études sur la liaison à CD36 n'ont été réalisées qu'avec HDMEC. L'inhibition de la cytoadhérence par l'anticorps αCD36 était variable et non significativement différente entre les isolats CM et UM (P = 0,23), bien qu'il y ait eu une tendance à une liaison CD36-dépendante plus élevée dans les isolats UM. La liaison dépendante de l'EPCR variait également, un sous-ensemble d'isolats se liant particulièrement bien à l'EPCR. Ceci était plus prononcé pour les isolats de CM se liant à HBMEC, mais pas significativement différent des isolats de MU (P = 0,073). Il n'y avait pas non plus de différence significative entre l'inhibition par rEPCR de la liaison à HBMEC et HDMEC. Pour quelques isolats, il y avait plus de liaison en présence d'anticorps αICAM-1 ou de rEPCR par rapport à la liaison en l'absence d'inhibiteur (Fig 3B et D), et c'était plus souvent le cas pour les isolats UM. La raison n'est pas claire ; nous n'avons pas pu collecter l'EI lié pour enquêter davantage sur ce phénomène. Figure 3. Inhibition of cytoadherence of IE from CM and UM cases to HDMEC and HBMEC by αICAM-1 and αCD36 antibody and rEPCR† A. IE were isolated, and binding to HBMEC and HDMEC was determined in flow conditions in the absence and presence of 5 μg/ml αICAM-1 or αCD36 antibody or 50 μg/ml rEPCR. Le nombre d'EI liés par mm2 de surface EC a été déterminé. B. En utilisant les mêmes données, le pourcentage d'inhibition par l'anticorps αICAM-1 a été calculé par rapport à la liaison en l'absence d'anticorps. C. En utilisant les mêmes données, le pourcentage d'inhibition par rEPCR a été calculé par rapport à la liaison en l'absence d'inhibiteur. D. En utilisant les mêmes données, le pourcentage d'inhibition par l'anticorps αCD36 a été calculé par rapport à la liaison en l'absence d'anticorps. Informations sur les données : (A) est l'analyse appariée entre l'absence et la présence d'inhibiteur, avec le nombre de cas (n) indiqué. La signification statistique a été déterminée par un test t apparié bilatéral, et la valeur P est indiquée ; ns n'est pas significatif. (B–D) sont l'IC moyen ± 95 %, et aucune différence significative n'a été déterminée avec un test t bilatéral non apparié. Chaque dosage n'a été effectué qu'une seule fois pour chaque isolat. Le nombre d'isolats testés peut être vu à partir du graphique à points. Télécharger la figure Télécharger les corrélations PowerPoint entre la liaison IE et les paramètres cliniques Nous avons évalué l'association entre les propriétés de cytoadhérence in vitro de l'IE et les paramètres cliniques associés à la séquestration. Pour les cas de CM, le degré de liaison de l'EI à l'HDMEC était positivement corrélé à la densité parasitaire périphérique au recrutement (r = 0,56, P = 0,011). La liaison de l'IE à l'HBMEC était moins clairement associée à la densité parasitaire périphérique (r = 0,40, P = 0,056). Les différences dans les niveaux de liaison n'étaient pas dues à la variation de la parasitémie de l'EI cultivé, car le test de liaison a été effectué à une parasitémie standardisée de 2%. La liaison des isolats de CM était négativement corrélée aux taux de plaquettes périphériques pour la liaison à l'HDMEC (r = −0,66, P = 0,001) et à l'HBMEC (r = −0,56, P = 0,005). Nous n'avons pas pu évaluer l'association entre l'adhésion à l'EI et l'issue fatale car seuls trois enfants pour lesquels nous avions des données contraignantes sont décédés. Aucune des autres caractéristiques cliniques, y compris les concentrations de protéine 2 riche en histidine, n'a montré de corrélation significative avec la cytoadhérence de l'EI. Pour les cas de MU, aucun des paramètres évalués n'était significativement corrélé avec la cytoadhérence. La densité parasitaire périphérique (selon la norme de l'OMS) et la numération plaquettaire n'ont pas été déterminées à l'admission dans les cas de MU ; cependant, après traitement des échantillons de sang de MU, la parasitémie a été déterminée par microscopie de frottis colorés à la Giemsa et aucune corrélation n'a été trouvée entre la parasitémie et l'intensité de liaison. Analyse des transcrits du gène VAR Pour analyser la structure du domaine PfEMP1 (figure 1) des isolats de patients, les niveaux de transcrits des gènes VAR codants ont été déterminés. La qPCR a été réalisée et les valeurs de transcrits VAR (Tu) ont été calculées et comparées entre les cas de CM et d'UM (tableau 2). Une description détaillée de la couverture, de la sensibilité et des limites<br/>Informe4 de enero de 2019Proceso transparente de acceso abierto La malaria cerebral se asocia con una citoadherencia diferencial a las células endoteliales cerebrales Janet Storm Autor correspondiente Janet Storm [email protected] orcid.org/0000-0001-7812-4220 Departamento de Parasitología, Liverpool School of Tropical Medicine, Liverpool, Reino Unido Malawi-Liverpool-Wellcome Trust Clinical Research Programme, Blantyre, Malawi College of Medicine, University of Malawi, Blantyre, Malawi Buscar más artículos de este autor Jakob S Jespersen Jakob S Jespersen orcid.org/0000-0002-4930-5900 Departamento de Salud Internacional, Inmunología y Microbiología, Centro de Parasitología Médica, Universidad de Copenhague, Copenhague, Dinamarca Departamento de Enfermedades Infecciosas, Rigshospitalet, Copenhague, Dinamarca Buscar más artículos de este autor Karl B Seydel Karl B Seydel College of Medicine, University of Malawi, Blantyre, Malawi Blantyre Malaria Project, College of Medicine, University of Malawi, Blantyre, Malawi Department of Osteopathic Medical Specialties, College of Osteopathic Medicine, Michigan State University, East Lansing, MI, EE. UU. Buscar más artículos de este autor Tadge Szestak Tadge Szestak Department of Parasitology, Liverpool School of Tropical Medicine, Liverpool, Reino Unido Buscar más artículos de este autor Maurice Mbewe Maurice Mbewe Malawi-Liverpool-Wellcome Trust Clinical Research Programa, Blantyre, Malawi Buscar más artículos de esta autora Ngawina V Chisala Ngawina V Chisala Malawi-Liverpool-Wellcome Trust Clinical Research Programme, Blantyre, Malawi Buscar más artículos de esta autora Patricia Phula Patricia Phula Malawi-Liverpool-Wellcome Trust Clinical Research Programme, Blantyre, Malawi Buscar más artículos de esta autora Christian W Wang Christian W Wang Departamento de Salud Internacional, Inmunología y Microbiología, Centro de Parasitología Médica, Universidad de Copenhague, Copenhague, Dinamarca Departamento de Enfermedades Infecciosas, Rigshospitalet, Copenhague, Dinamarca Buscar más artículos de esta autora Terrie E Taylor Terrie E Taylor Blantyre Malaria Project, College of Medicine, University of Malawi, Blantyre, Malawi Department of Osteopathic Medical Specialties, College of Osteopathic Medicine, Michigan State University, East Lansing, MI, usa Buscar más artículos de este autor Christopher A Moxon Christopher A Moxon Institute of Infection and Global Health, University of Liverpool, Liverpool, UK Wellcome Centre for Molecular Parasitology, Institute of Infection, Immunity and Inflammation, College of Medical Veterinary & Life Sciences, University of Glasgow, Glasgow, UK Buscar más artículos de este autor Thomas Lavstsen Thomas Lavstsen orcid.org/0000-0002-3044-4249 Departamento de Salud Internacional, Inmunología y Microbiología, Centro de Parasitología Médica, Universidad de Copenhague, Copenhague, Dinamarca Departamento de Enfermedades Infecciosas, Rigshospitalet, Copenhague, Dinamarca Buscar más artículos de este autor Alister G Craig Autor Correspondiente Alister G Craig [email protected] orcid.org/0000-0003-0914-6164 Departamento de Parasitología, Liverpool School of Tropical Medicine, Liverpool, Reino Unido Buscar más artículos de este autor Janet Storm Autor Correspondiente Janet Storm [email protected] orcid.org/0000-0001-7812-4220 Departamento de Parasitología, Liverpool School of Tropical Medicine, Liverpool, Reino Unido Malawi-Liverpool-Wellcome Trust Programa de Investigación Clínica, Blantyre, Malawi College of Medicine, Universidad de Malawi, Blantyre, Malawi Buscar más artículos de este autor Jakob S Jespersen Jakob S Jespersen orcid.org/0000-0002-4930-5900 Departamento de Salud Internacional, Inmunología y Microbiología, Centro de Parasitología Médica, Universidad de Copenhague, Copenhague, Dinamarca Departamento de Enfermedades Infecciosas, Rigshospitalet, Copenhague, Dinamarca Buscar más artículos de este autor Karl B Seydel Karl B Seydel College of Medicine, Universidad de Malawi, Blantyre, Malawi Blantyre Malaria Project, Facultad de Medicina, Universidad de Malawi, Blantyre, Departamento de Especialidades Médicas Osteopáticas de Malawi, Facultad de Medicina Osteopática, Michigan State University, East Lansing, MI, EE. UU. Buscar más artículos de este autor Tadge Szestak Tadge Szestak Department of Parasitology, Liverpool School of Tropical Medicine, Liverpool, UK Buscar más artículos de este autor Maurice Mbewe Maurice Mbewe Malawi-Liverpool-Wellcome Trust Clinical Research Programme, Blantyre, Malawi Buscar más artículos de este autor Ngawina V Chisala Ngawina V Chisala Malawi-Liverpool-Wellcome Trust Clinical Research Programme, Blantyre, Malawi Buscar más artículos de esta autora Patricia Phula Patricia Phula Malawi-Liverpool-Wellcome Trust Clinical Research Programme, Blantyre, Malawi Buscar más artículos de este autor Christian W Wang Christian W Wang Departamento de Salud Internacional, Inmunología y Microbiología, Centro de Parasitología Médica, Universidad de Copenhague, Copenhague, Dinamarca Departamento de Enfermedades Infecciosas, Rigshospitalet, Copenhague, Dinamarca Buscar más artículos de este autor Terrie E Taylor Terrie E Taylor Blantyre Malaria Project, Facultad de Medicina, Universidad de Malawi, Blantyre, Departamento de Especialidades Médicas Osteopáticas de Malawi, Facultad de Medicina Osteopática, Universidad Estatal de Michigan, East Lansing, MI, EE. UU. Buscar más artículos de este autor Christopher A Moxon Christopher A Moxon Institute of Infection and Global Health, University of Liverpool, Liverpool, UK Wellcome Centre for Molecular Parasitology, Institute of Infection, Immunity and Inflammation, College of Medical Veterinary & Life Sciences, University of Glasgow, Glasgow, UK Search for more papers by this author Thomas Lavstsen Thomas Lavstsen orcid.org/0000-0002-3044-4249 Department of International Health, Immunology & Microbiology, Centre for Medical Parasitology, University of Copenhagen, Copenhagen, Denmark Department of Infectious Diseases, Rigshospitalet, Copenhagen, Denmark Search for more papers by this author Alister G Craig Corresponding Author Alister G Craig [email protected] orcid.org/0000-0003-0914-6164 Department of Parasitology, Liverpool School of Tropical Medicine, Liverpool, Reino Unido Buscar más artículos de este autor Información del autor Janet Storm *,1,2,3, Jakob S Jespersen4,5, Karl B Seydel3,6,7, Tadge Szestak1, Maurice Mbewe2, Ngawina V Chisala2, Patricia Phula2, Christian W Wang4,5, Terrie E Taylor6,7, Christopher A Moxon8,9, Thomas Lavstsen4,5 y Alister G Craig *,1 1Departamento de Parasitología, Liverpool School of Tropical Medicine, Liverpool, Reino Unido 2Malawi-Liverpool-Wellcome Trust Clinical Research Programme, Blantyre, Malawi 3College of Medicine, University of Malawi, Blantyre, Malawi 4Department of International Health, Immunology & Microbiology, Centre para Parasitología Médica, Universidad de Copenhague, Copenhague, Dinamarca 5Departamento de Enfermedades Infecciosas, Rigshospitalet, Copenhague, Dinamarca 6Blantyre Malaria Project, Facultad de Medicina, Universidad de Malawi, Blantyre, Malawi 7Departamento de Especialidades Médicas Osteopáticas, Facultad de Medicina Osteopática, Universidad Estatal de Michigan, East Lansing, MI, EE. UU. 8Instituto de Infección y Salud Global, Universidad de Liverpool, Liverpool, Reino Unido 9Centro de Bienvenida para Parasitología Molecular, Instituto de Infección, Inmunidad e Inflamación, Facultad de Medicina Veterinaria y Ciencias de la Vida, Universidad de Glasgow, Glasgow, Reino Unido *Autor correspondiente. Tel: +44 151 705 3297; Correo electrónico: [email protected] *Autor correspondiente. Tel: +44 151 705 3161; E-mail: [email protected] EMBO Mol Med (2019)11: e9164https://doi.org/10.15252/emmm.201809164PDFDescargar PDF del texto del artículo y las figuras principales. Revisión por pares: descargue un resumen del proceso de decisión editorial, incluidas las cartas de decisión editorial, los comentarios del revisor y las respuestas del autor a los comentarios. HerramientasAñadir a favoritosDescargar citasTrack CitationsPermissions ShareFacebookTwitterLinked InMendeleyWechatReddit Figures & Info El secuestro abstracto de eritrocitos (IE) infectados por Plasmodium falciparum dentro de la microvasculatura cerebral es un sello distintivo de la malaria cerebral (CM). Usando un ensayo de adhesión de flujo de microcanales con células endoteliales microvasculares humanas primarias activadas por TNF, demostramos que el IE aislado de casos de CM pediátricos de Malawi mostró una mayor unión a las células endoteliales microvasculares cerebrales en comparación con el IE de casos de malaria no complicada (UM). Además, los aislados de UM mostraron una adhesión significativamente mayor a las células endoteliales microvasculares dérmicas que a las cerebrales. El principal mediador de la adhesión del parásito es la proteína 1 de la membrana eritrocitaria de P. falciparum, codificada por los genes VAR. Se detectaron niveles más altos de transcritos del gen VAR que se predijo que se unirían al receptor de la proteína C endotelial del huésped (EPCR) e ICAM-1 en aislados de CM. Estos datos proporcionan evidencia adicional de la unión tisular diferencial en síndromes de malaria graves y no complicados, y respaldan adicionalmente la hipótesis de que la patología de CM se basa en una mayor citoadherencia de IE en la microvasculatura cerebral. Sinopsis La citoadherencia de los eritrocitos infectados por Plasmodium falciparum (IE) a las células endoteliales que recubren los vasos cerebrales es un sello distintivo de la malaria cerebral (CM). Este estudio muestra que la capacidad de IE para citoadherirse en el cerebro de pacientes con CM y malaria no complicada está asociada con la enfermedad. La IE de niños con malaria no complicada no se une bien a las células endoteliales cerebrales, mientras que la IE de pacientes con CM muestra altos niveles de unión. Se observaron asociaciones significativas en la unión de IE a las células endoteliales cerebrales tanto para ICAM-1 como para EPCR. Las variantes de PfEMP1 que contienen motivos de unión a EPCR se asociaron con malaria cerebral. Introducción A pesar de las reducciones significativas en la mortalidad y morbilidad de la malaria en la última década, el porcentaje de pacientes infectados con Plasmodium falciparum que sucumben a la malaria grave (MS) no está cambiando (OMS, 2017), y la malaria cerebral (CM) contribuye a gran parte de la mortalidad. La tasa de mortalidad general para CM en niños es del 15–25%, con un estudio reciente de resonancia magnética que muestra que la inflamación cerebral está fuertemente asociada con un resultado fatal en CM (Seydel et al, 2015). La patología de la CM se ha estudiado extensamente (Idro et al, 2005; Hawkes et al, 2013) pero también se ha debatido durante muchas décadas, como se discutió en numerosas revisiones (Shikani et al, 2012; Cunnington et al, 2013; Storm & Craig, 2014; Wassmer & Grau, 2017). Lo que está claro es que la patogénesis es multifactorial, con un papel para la respuesta inmune a la infección por Plasmodium (Hunt & Grau, 2003; Ioannidis et al, 2014; Dieye et al, 2016; Mandala et al, 2017; Wolf et al, 2017) y la obstrucción de la microvasculatura por secuestro y rosetado (Rowe et al, 2009; Craig et al, 2012; Ponsford et al, 2012; White et al, 2013; Milner et al, 2015), lo que lleva a la disfunción endotelial. El secuestro de eritrocitos (IE) infectados por P. falciparum en la microvasculatura cerebral es un sello distintivo del CM humano como se muestra en los estudios post mortem (Pongponratn et al, 1991; Taylor et al, 2004), pero si este secuestro se debe a la unión diferencial de IE al endotelio cerebral ha sido más difícil de demostrar. El principal mediador de la citoadherencia del parásito al endotelio es la proteína 1 de la membrana eritrocitaria de P. falciparum (PfEMP1), un antígeno de superficie variante expresado en perillas en la superficie del IE y codificado por aproximadamente 60 genes VAR por genoma del parásito, con solo un PfEMP1 expresado en la superficie de cualquier IE individual (Scherf et al, 2008; Pasternak & Dzikowski, 2009). PfEMP1 se compone de múltiples dominios similares a la unión de Duffy (DBL) y de la región interdominio rica en cisteína (CIDR) y se puede clasificar en cuatro grupos principales A, B, C y E en función de la secuencia 5'aguas arriba del gen VAR codificante (Fig 1; Smith, 2014). PfEMP1 se une a una variedad de receptores e incluye los fenotipos mutuamente excluyentes CD36 y receptor de proteína C endotelial (EPCR), mediados por dominios CIDR N-terminales (Kraemer & Smith, 2006; Semblat et al, 2006, 2015; Rask et al, 2010; Hviid & Jensen, 2015). Aproximadamente la mitad de PfEMP1 del grupo A y un subconjunto de PfEMP1 quimérico del grupo B/A, también conocido como casete de dominio 8 (DC8), se unen a EPCR a través de dominios CIDRα1, mientras que PfEMP1 del grupo B y C se unen a CD36 a través de dominios CIDRα2-CIDRα6. Además, la unión a la molécula de adhesión intercelular 1 (ICAM-1) está mediada a través de dominios DBLβ adyacentes a los dominios CIDR y en algunos casos se ha asociado con un fenotipo de unión dual con EPCR (Lennartz et al, 2017). Figura 1. Estructura del dominio PfEMP1Una presentación esquemática de la estructura del dominio PfEMP1 que comprende una estructura de cabeza N-terminal, 2-6 dominios C-terminales posteriores, un dominio transmembrana (TM) y un segmento terminal ácido intracelular (ATS) con receptores conocidos indicados en negrita. La especificidad del receptor se determina mediante dominios DBL y CIDR combinados con unión mutuamente exclusiva a EPCR y CD36 por diferentes dominios CIDRα en la estructura de la cabeza. Parte de PfEMP1 del grupo A y un subconjunto particular de PfEMP1 quimérico del grupo B/A (DC8) se unen a EPCR a través de dominios CIDRα1, mientras que PfEMP1 del grupo B y C se unen a CD36 a través de dominios CIDRα2-6. El grupo atípico E VAR2CSA PfEMP1 se une al sulfato de condroitina placentario A (CSA) a través de los dominios DBLpam1 y DBLpam2. Se desconoce el fenotipo de unión de los dominios VAR 1, VAR3 y CIDRβ/γ/δ del grupo A, pero no se unen a EPCR o CD36. Los dominios DBLβ pueden estar involucrados en la unión de ICAM-1 y son de ambos grupos A y B. No se sabe mucho sobre los otros dominios DBL (γ/δ/ε/ζ), pero los dominios DBLε y DBLζ están implicados en la unión de IgM y α2-macroglobulina. Descargar figura Descargar PowerPoint Al elegir qué receptores del huésped estudiar, tuvimos en cuenta los hallazgos de que las categorías de tipos de PfEMP1 también están asociadas con la expresión in vivo en SM. Un ejemplo particularmente fuerte de esto es cuando los parásitos que expresan genes VAR que codifican PfEMP1 que contienen dominios de unión a EPCR han demostrado una fuerte asociación con el desarrollo de SM, incluido CM (Avril et al, 2012; Claessens et al, 2012; Lavstsen et al, 2012; Bengtsson et al, 2013; Bertin et al, 2013; Jespersen et al, 2016; Kessler et al, 2017; Mkumbaye et al, 2017). In vitro, los parásitos que expresan PfEMP1 de unión a EPCR muestran mayores grados de unión a EPCR, así como a los receptores ICAM-1, ambos expresados en el endotelio microvascular cerebral (Turner et al, 2013; Avril et al, 2016; Lennartz et al, 2017). La unión de ICAM-1 se ha mapeado a algunos, pero no a todos, los dominios DBLβ que se encuentran adyacentes a los dominios CIDR N-terminales en aproximadamente un tercio de todos los PfEMP1. Recientemente se demostró que un subconjunto de dominios DBLβ de unión a ICAM-1 es específico para PfEMP1 de unión a EPCR del grupo A y se encontró que se expresa a niveles más altos en parásitos de pacientes con CM que en parásitos de pacientes sin CM (Lennartz et al, 2017). Los parásitos que expresan PfEMP1 de unión a CD36 se encuentran en muchos aislados de pacientes independientemente de los síntomas, aunque algunos datos sugieren que pueden constituir una menor proporción de parásitos en pacientes con SM (Heddini et al, 2001; Ndam et al, 2017), y no se observan en aislados de parásitos tomados de mujeres con malaria placentaria (Smith et al, 2013). Sin embargo, se han descrito varios otros receptores huésped para PfEMP1, mientras que se han identificado proteínas PfEMP1 que se unen a estos receptores (Berger et al, 2013), no se han establecido vínculos entre la citoadherencia y el CM pediátrico, y estos no se probaron en nuestro estudio. Los eritrocitos infectados que se unen a receptores específicos durante una infección pueden tener diferentes consecuencias funcionales en el endotelio y, por lo tanto, en la gravedad de la enfermedad. Un ejemplo claro es que al unirse a EPCR, el IE interfiere con la producción de proteína C activada, lanzando así la cascada de coagulación, lo que conduce a una mayor producción de trombina (Moxon et al, 2013) y al potencial de causar una activación endotelial mediada por PAR1 proinflamatoria (Petersen et al, 2015; Gillrie et al, 2016). Se ha demostrado que otras interacciones PfEMP1-receptor activan las vías de señalización en las células endoteliales (Wu et al, 2011; Gillrie & Ho, 2017), pero el efecto de estos eventos en la patología no está claro. Un trabajo más reciente también ha sugerido que, además de los eventos mediados por la citoadherencia, la acumulación de IE secuestrado en los vasos puede facilitar la disfunción endotelial causada por la liberación local de mediadores solubles después de la ruptura del esquizonte (Gallego-Delgado y Rodríguez, 2017). Por lo tanto, no está claro por qué un niño en particular desarrolla CM en un momento determinado, ya que la gran mayoría de las infecciones por P. falciparum no conducen a CM. Además, la mayoría de los niños africanos que desarrollan CM han tenido malaria previamente sin desarrollar CM. Un posible mecanismo para explicar por qué un niño desarrolla CM en un momento determinado es que ha sido infectado con una variante de P. falciparum que facilita el reclutamiento de IE al endotelio en el cerebro. Si bien múltiples líneas de evidencia indican que las variantes específicas de PfEMP1 están asociadas con la malaria grave, esa asociación no se ha fundamentado midiendo directamente la unión de IE a las células endoteliales (EC). Por lo tanto, no se ha probado la cuestión de si la IE de niños con CM tiene propiedades de citoadherencia que les permitan unirse al endotelio cerebral y, por lo tanto, mejorar su secuestro en ese sitio. Se desconoce el alcance del secuestro en el cerebro para los casos que no son CM, aunque las observaciones post mortem de vasos cerebrales de niños infectados con malaria que mueren por otras causas de coma (no CM) muestran niveles mucho más bajos de secuestro de IE que los casos de CM (Milner et al, 2015). Por lo tanto, como comparación, los aislados de niños con malaria no complicada (UM) también se han probado para determinar su fenotipo de unión en el presente estudio. Varios estudios han investigado la citoadherencia de variantes específicas de PfEMP1 a células endoteliales microvasculares humanas, pero estos han sido con cepas de laboratorio o parásitos modificados con PfEMP1 (Madkhali et al, 2014; Gillrie et al, 2015). Los aislados de pacientes también se han investigado por su fenotipo de unión, pero principalmente en proteínas purificadas y principalmente en condiciones estáticas (Craig et al, 2012; Almelli et al, 2014; Mahamar et al, 2017; Ndam et al, 2017). Si bien proporcionaron pruebas importantes, estos estudios no pudieron, en gran medida por razones técnicas, combinar el objetivo más apropiado (endotelio cerebral primario) y los aislados de parásitos lo más cerca posible de la muestra del paciente, con un ensayo fisiológicamente relevante. Para abordar nuestra hipótesis de que el CM está impulsado por una mayor unión del IE al endotelio cerebral, evaluamos si el IE recién aislado de la sangre circulante de niños con CM se unía preferentemente al endotelio microvascular cerebral primario activado por TNF, en comparación con el IE aislado de niños con UM. Postulamos que tal diferencia podría estar asociada con la expresión de variantes particulares de PfEMP1 y con la unión a receptores endoteliales específicos. Recolectamos IE de casos de CM y UM pediátricos cuidadosamente caracterizados en Malawi y determinamos la citoadherencia a células endoteliales microvasculares humanas primarias, con una expansión mínima in vitro de la población de parásitos, utilizando un dispositivo de flujo microfluídico, un diseño experimental que refleja la fisiología in vivo. La expresión de las variantes de PfEMP1 se investigó mediante qPCR utilizando el conjunto más actualizado de cebadores específicos del tipo de dominio VAR disponibles para nosotros. Hasta donde sabemos, este estudio es el primero en emplear un enfoque tan integral para abordar la cuestión de si la citoadherencia está involucrada en la patogénesis de CM. Resultados Reclutamiento de participantes del estudio Los niños fueron reclutados durante tres temporadas de malaria de 2013 a 2015 utilizando los criterios de selección descritos en la sección Materiales y métodos. El total de casos de CM admitidos en la sala de investigación ha disminuido desde 2010, de 165 casos a 48 (18) casos en 2013, 78 (26) en 2014 y 43 (14) en 2015. Los números entre paréntesis son el número de niños reclutados para nuestro estudio de citoadherencia. Para mejorar la especificidad del diagnóstico clínico de CM, solo se incluyeron niños con al menos una característica de retinopatía palúdica (Maccormick et al, 2014), lo que resultó en el reclutamiento de un total de 58 casos. Se incluyeron un total de 53 casos de UM, emparejados anualmente con el número de casos de CM. Las características clínicas de las cohortes totales de UM y CM y los casos utilizados para los experimentos se resumen en la Tabla 1. La mediana de edad de los niños con MU fue mayor que la de los niños con MC. En comparación con los niños con UM, los niños con CM tenían una mediana de pulso y frecuencias respiratorias significativamente más altas, una mediana de concentración de lactato más alta y una mediana de niveles de hematocrito más bajos, indicadores de enfermedad grave (OMS, 2016). Diez de los niños con CM (17%) murieron. Para lograr una parasitemia del 2% necesaria para los ensayos de citoadherencia, solo se utilizaron muestras de sangre de niños con al menos un 2% de parasitemia periférica. Las características clínicas de estos casos seleccionados fueron similares a la cohorte general de niños con cada uno de estos síndromes clínicos. Tabla 1. Características clínicas de los participantes en el estudio Cohorte total de malaria no complicada (n = 53) Cohorte total de malaria cerebral (n = 60) Valor P Utilizado en el ensayo de malaria no complicada (n = 35) Utilizado en el ensayo de malaria cerebral (n = 27) Valor P Edad, meses 51 (30–74) 42 (24–59) 0.04 53 (38–89) 36 (23–50) 0.005 Género, % femenino 53 47 51 48 Temperatura axilar, °C 38.8 (38.2-39.4) 39.0 (38.1-40.0) 38.8 (381-39.4) 39.0 (37.9-40.0) Frecuencia de pulso, latidos/min 124 (107–140) 157 (140–175) < 0.0001 124 (114-146) 156 (133–175) 0.0001 Presión arterial sistólica, mmHg 98 (91–102) 95 (86–104) a 97 (91–99) 94 (85–103)b Frecuencia respiratoria, respiraciones/min 30 (25–30) 40 (36–52) < 0,0001 28 (24–30) 41 (32–52) < 0,0001 Glucosa en sangre, mmol/l 5,7 (5,1-6,4) 5,4 (4,4-6,8) 5,8 (5,1-6,5) 5,0 (4,5-6,7) Lactato en sangre, mmol/l 2,9 (2,0-3,4) 4,5 (2,4-8,8) < 0,0001 2,9 (1,9-3,5) 4,6 (2,3-8,2) 0,0006 Hematocrito, % 35,0 (30,0-38,0) 22,0 (18,0-25,6) < 0,0001 36,0 (29,5-38,0) 20,4 (16,8-25,1) < 0,0001 HRP2, μg/ml 7,1 (2,2-9,9)c 9,5 (3,1-11,0)d Parasitaemia, parásitos/×104) 11,8 (4,2-38,4) 29,8 (14.6–59.9) Plaquetas/μl (×104) 4.9 (2.4–9.6)c 4.9 (2.4–9.8)d Se muestra la mediana con el rango intercuartílico entre paréntesis para la cohorte total y los casos utilizados en los ensayos de unión. Para cada variable, las diferencias estadísticas entre los casos de UM y CM se determinaron mediante la prueba U de Mann–Whitney (variables continuas) o la prueba exacta de Fisher (variables categóricas), y se indican valores de P < 0.05. HRP2 = proteína 2 rica en histidina. Tamaño del grupo en a = 50, b = 21, c = 55 y d = 24 niños. Citoadherencia de aislados clínicos a células endoteliales microvasculares bajo flujo Se cultivaron IE aislados hasta que los parásitos estaban en la etapa de trofozoito, cuando se expresa PfEMP1 en la superficie del IE, y se preparó una suspensión de parasitemia al 2% y hematocrito al 5%. Utilizando el dispositivo microfluídico, se determinó la citoadherencia a las células endoteliales microvasculares humanas primarias, derivadas del cerebro (HBMEC) y la dermis (HDMEC), en condiciones de flujo. Los aislados de casos de CM demostraron una unión promedio de 110 IE/mm2 (IC del 95%: 37–182) a HBMEC que fue significativamente mayor (P = 0.041) que la unión de HBMEC de casos de UM a 43 IE/mm2 (IC del 95%: 28–57; Fig. 2). Por el contrario, no hubo diferencia en la unión a HDMEC (P = 0.171) entre el IE de los casos de CM (promedio 165 IE/mm2, IC del 95%: 81–250) y los casos de UM (promedio 110 IE/mm2, IC del 95%: 71–149). La unión de los aislados de UM a HBMEC fue significativamente menor en comparación con HDMEC (P = 0.002), que no fue el caso de los aislados de CM. Para los aislados de pacientes con CM, la unión de Avid fue una característica común; los aislados que se unieron bien a HBMEC también se unieron bien a HDMEC con un coeficiente de correlación de Spearman de 0.83 (P < 0.0001). Para los aislados de UM, sin embargo, no hubo correlación entre la unión a HBMEC y HDMEC (r = 0,20, P = 0,28). Una publicación reciente de Azasi et al (2018b) mostró que DC8-PfEMP1 que expresa IE no se une a EPCR en presencia de suero humano normal. Por lo tanto, probamos si la adición de suero humano al 10% al amortiguador de unión disminuiría la citoadherencia de los aislados de pacientes seleccionados a HBMEC (Apéndice Fig. S2). El suero humano no cambió la unión de tres aislados de pacientes que mostraron una unión significativa DE EPCR a HBMEC. La unión de la variante de DC8 IT4var19 tampoco se vio afectada por la adición de suero humano en nuestro sistema de ensayo de flujo. Figura 2. Se aisló la citoadherencia de IE de casos de CM y UM a HBMEC y HDMECIE, y se determinó la unión a HBMEC y HDMEC en condiciones de flujo. Se calculó el número de IE unidos por mm2 de superficie EC y se muestra la media ± 95% CI para casos de 26 CM y 33 UM en HBMEC y casos de 21 CM y 35 UM en HDMEC en una escala logarítmica. El valor P se calculó mediante la prueba t no apareada de dos colas. La línea punteada es 20 IE/mm2, el valor de corte para la inclusión de los datos de inhibición. Figura de descarga Descargar PowerPoint Inhibición de la citoadherencia a las células endoteliales microvasculares bajo flujo Para evaluar el papel diferencial de los receptores endoteliales ICAM-1, EPCR y CD36, se determinó la unión en presencia de anticuerpos inhibidores, αICAM-1 y αCD36, o proteína recombinante, rEPCR (Fig 3). El análisis emparejado de los datos de unión de inhibición se muestra en la Figura 3A y se observó una inhibición significativa para todas las combinaciones de EC-inhibidor, excepto para la inhibición de la unión de los aislados de UM a HDMEC por rEPCR. Los datos se resumen como porcentaje de inhibición en la Fig. 3B–D, para comparar la adherencia dependiente del receptor entre CM y UM. Aproximadamente la mitad del IE mostró una unión dependiente de ICAM-1 (> 50% de inhibición) tanto a HBMEC como a HDMEC, pero no hubo diferencias significativas entre los aislamientos de CM y UM ni entre la dependencia de la unión de ICAM-1 a HBMEC y HDMEC. La expresión de CD36 es extremadamente baja en HBMEC primaria (Avril et al, 2016), por lo que los estudios sobre la unión a CD36 solo se realizaron con HDMEC. La inhibición de la citoadherencia por el anticuerpo αCD36 fue variable y no significativamente diferente entre los aislados de CM y UM (P = 0.23), aunque hubo una tendencia a una mayor unión dependiente de CD36 en los aislados de UM. La unión dependiente de EPCR también varió, con un subconjunto de aislados que se unieron particularmente bien a EPCR. Esto fue más pronunciado para los aislados de CM que se unen a HBMEC, pero no significativamente diferente de los aislados de UM (P = 0.073). Tampoco hubo diferencias significativas entre la inhibición de rEPCR de la unión a HBMEC y HDMEC. Para algunos aislados, hubo más unión en presencia de anticuerpo αICAM-1 o rEPCR en comparación con la unión en ausencia de inhibidor (Fig 3B y D), y este fue el caso más frecuente para los aislados de UM. La razón de esto no está clara; no pudimos recopilar el IE vinculado para investigar más a fondo este fenómeno. Figura 3. Se aisló la inhibición de la citoadherencia de IE de los casos de CM y UM a HDMEC y HBMEC por el anticuerpo αICAM-1 y αCD36 y rEPCR † A. IE, y se determinó la unión a HBMEC y HDMEC en condiciones de flujo en ausencia y presencia de 5 μg/ml de anticuerpo αICAM-1 o αCD36 o 50 μg/ml de rEPCR. Se determinó el número de IE unidos por mm2 de superficie EC. B. Usando los mismos datos, el porcentaje de inhibición por el anticuerpo αICAM-1 se calculó en relación con la unión en ausencia de anticuerpo. C. Usando los mismos datos, el porcentaje de inhibición por rEPCR se calculó en relación con la unión en ausencia de inhibidor. D. Usando los mismos datos, el porcentaje de inhibición por el anticuerpo αCD36 se calculó en relación con la unión en ausencia de anticuerpo. Información de datos: (A) se muestra el análisis emparejado entre la ausencia y la presencia de inhibidor, con el número de casos (n) indicado. La significación estadística se determinó mediante la prueba t pareada de dos colas, y se muestra el valor P; ns no es significativo. (B–D) se muestran la media ± IC del 95%, y no se determinaron diferencias significativas con una prueba t no apareada de dos colas. Cada ensayo se realizó solo una vez para cada aislado. El número de aislados probados se puede ver en el gráfico de puntos. Figura de descarga Descargar PowerPoint Correlaciones entre la unión de IE y los parámetros clínicos Evaluamos la asociación entre las propiedades de citoadherencia in vitro del IE y los parámetros clínicos asociados con el secuestro. Para los casos de CM, el grado de unión de IE a HDMEC se correlacionó positivamente con la densidad de parásitos periféricos en el reclutamiento (r = 0.56, P = 0.011). La unión de IE a HBMEC se asoció menos claramente con la densidad de parásitos periféricos (r = 0,40, P = 0,056). Las diferencias en los niveles de unión no se debieron a la variación en la parasitemia del IE cultivado, ya que el ensayo de unión se realizó con una parasitemia estandarizada del 2%. La unión de los aislados de CM se correlacionó negativamente con los niveles de plaquetas periféricas tanto para la unión a HDMEC (r = -0,66, P = 0,001) como para HBMEC (r = -0,56, P = 0,005). No pudimos evaluar la asociación entre la adhesión de IE y el resultado fatal, ya que solo murieron tres niños para los que teníamos datos vinculantes. Ninguna de las otras características clínicas, incluidas las concentraciones de proteína 2 rica en histidina, mostró una correlación significativa con la citoadherencia de IE. Para los casos de UM, ninguno de los parámetros evaluados se correlacionó significativamente con la citoadherencia. La densidad de parásitos periféricos (según el estándar de la OMS) y los recuentos de plaquetas no se determinaron al ingreso en los casos de UM; sin embargo, después de procesar las muestras de sangre de UM, se determinó la parasitemia mediante microscopía de frotis teñidos con Giemsa y no se encontró correlación entre la parasitemia y la intensidad de unión. Análisis de transcritos de genes var Para analizar la estructura del dominio PfEMP1 (Fig 1) de los aislados del paciente, se determinaron los niveles de transcrito de los genes var codificantes. Se realizó qPCR y se calcularon los valores de transcrito var (Tu) y se compararon entre los casos de CM y UM (Tabla 2). Una descripción detallada de la cobertura, la sensibilidad y los límites<br/>Report4 January 2019Open Access Transparent process Cerebral malaria is associated with differential cytoadherence to brain endothelial cells Janet Storm Corresponding Author Janet Storm [email protected] orcid.org/0000-0001-7812-4220 Department of Parasitology, Liverpool School of Tropical Medicine, Liverpool, UK Malawi-Liverpool-Wellcome Trust Clinical Research Programme, Blantyre, Malawi College of Medicine, University of Malawi, Blantyre, Malawi Search for more papers by this author Jakob S Jespersen Jakob S Jespersen orcid.org/0000-0002-4930-5900 Department of International Health, Immunology & Microbiology, Centre for Medical Parasitology, University of Copenhagen, Copenhagen, Denmark Department of Infectious Diseases, Rigshospitalet, Copenhagen, Denmark Search for more papers by this author Karl B Seydel Karl B Seydel College of Medicine, University of Malawi, Blantyre, Malawi Blantyre Malaria Project, College of Medicine, University of Malawi, Blantyre, Malawi Department of Osteopathic Medical Specialties, College of Osteopathic Medicine, Michigan State University, East Lansing, MI, USA Search for more papers by this author Tadge Szestak Tadge Szestak Department of Parasitology, Liverpool School of Tropical Medicine, Liverpool, UK Search for more papers by this author Maurice Mbewe Maurice Mbewe Malawi-Liverpool-Wellcome Trust Clinical Research Programme, Blantyre, Malawi Search for more papers by this author Ngawina V Chisala Ngawina V Chisala Malawi-Liverpool-Wellcome Trust Clinical Research Programme, Blantyre, Malawi Search for more papers by this author Patricia Phula Patricia Phula Malawi-Liverpool-Wellcome Trust Clinical Research Programme, Blantyre, Malawi Search for more papers by this author Christian W Wang Christian W Wang Department of International Health, Immunology & Microbiology, Centre for Medical Parasitology, University of Copenhagen, Copenhagen, Denmark Department of Infectious Diseases, Rigshospitalet, Copenhagen, Denmark Search for more papers by this author Terrie E Taylor Terrie E Taylor Blantyre Malaria Project, College of Medicine, University of Malawi, Blantyre, Malawi Department of Osteopathic Medical Specialties, College of Osteopathic Medicine, Michigan State University, East Lansing, MI, USA Search for more papers by this author Christopher A Moxon Christopher A Moxon Institute of Infection and Global Health, University of Liverpool, Liverpool, UK Wellcome Centre for Molecular Parasitology, Institute of Infection, Immunity and Inflammation, College of Medical Veterinary & Life Sciences, University of Glasgow, Glasgow, UK Search for more papers by this author Thomas Lavstsen Thomas Lavstsen orcid.org/0000-0002-3044-4249 Department of International Health, Immunology & Microbiology, Centre for Medical Parasitology, University of Copenhagen, Copenhagen, Denmark Department of Infectious Diseases, Rigshospitalet, Copenhagen, Denmark Search for more papers by this author Alister G Craig Corresponding Author Alister G Craig [email protected] orcid.org/0000-0003-0914-6164 Department of Parasitology, Liverpool School of Tropical Medicine, Liverpool, UK Search for more papers by this author Janet Storm Corresponding Author Janet Storm [email protected] orcid.org/0000-0001-7812-4220 Department of Parasitology, Liverpool School of Tropical Medicine, Liverpool, UK Malawi-Liverpool-Wellcome Trust Clinical Research Programme, Blantyre, Malawi College of Medicine, University of Malawi, Blantyre, Malawi Search for more papers by this author Jakob S Jespersen Jakob S Jespersen orcid.org/0000-0002-4930-5900 Department of International Health, Immunology & Microbiology, Centre for Medical Parasitology, University of Copenhagen, Copenhagen, Denmark Department of Infectious Diseases, Rigshospitalet, Copenhagen, Denmark Search for more papers by this author Karl B Seydel Karl B Seydel College of Medicine, University of Malawi, Blantyre, Malawi Blantyre Malaria Project, College of Medicine, University of Malawi, Blantyre, Malawi Department of Osteopathic Medical Specialties, College of Osteopathic Medicine, Michigan State University, East Lansing, MI, USA Search for more papers by this author Tadge Szestak Tadge Szestak Department of Parasitology, Liverpool School of Tropical Medicine, Liverpool, UK Search for more papers by this author Maurice Mbewe Maurice Mbewe Malawi-Liverpool-Wellcome Trust Clinical Research Programme, Blantyre, Malawi Search for more papers by this author Ngawina V Chisala Ngawina V Chisala Malawi-Liverpool-Wellcome Trust Clinical Research Programme, Blantyre, Malawi Search for more papers by this author Patricia Phula Patricia Phula Malawi-Liverpool-Wellcome Trust Clinical Research Programme, Blantyre, Malawi Search for more papers by this author Christian W Wang Christian W Wang Department of International Health, Immunology & Microbiology, Centre for Medical Parasitology, University of Copenhagen, Copenhagen, Denmark Department of Infectious Diseases, Rigshospitalet, Copenhagen, Denmark Search for more papers by this author Terrie E Taylor Terrie E Taylor Blantyre Malaria Project, College of Medicine, University of Malawi, Blantyre, Malawi Department of Osteopathic Medical Specialties, College of Osteopathic Medicine, Michigan State University, East Lansing, MI, USA Search for more papers by this author Christopher A Moxon Christopher A Moxon Institute of Infection and Global Health, University of Liverpool, Liverpool, UK Wellcome Centre for Molecular Parasitology, Institute of Infection, Immunity and Inflammation, College of Medical Veterinary & Life Sciences, University of Glasgow, Glasgow, UK Search for more papers by this author Thomas Lavstsen Thomas Lavstsen orcid.org/0000-0002-3044-4249 Department of International Health, Immunology & Microbiology, Centre for Medical Parasitology, University of Copenhagen, Copenhagen, Denmark Department of Infectious Diseases, Rigshospitalet, Copenhagen, Denmark Search for more papers by this author Alister G Craig Corresponding Author Alister G Craig [email protected] orcid.org/0000-0003-0914-6164 Department of Parasitology, Liverpool School of Tropical Medicine, Liverpool, UK Search for more papers by this author Author Information Janet Storm *,1,2,3, Jakob S Jespersen4,5, Karl B Seydel3,6,7, Tadge Szestak1, Maurice Mbewe2, Ngawina V Chisala2, Patricia Phula2, Christian W Wang4,5, Terrie E Taylor6,7, Christopher A Moxon8,9, Thomas Lavstsen4,5 and Alister G Craig *,1 1Department of Parasitology, Liverpool School of Tropical Medicine, Liverpool, UK 2Malawi-Liverpool-Wellcome Trust Clinical Research Programme, Blantyre, Malawi 3College of Medicine, University of Malawi, Blantyre, Malawi 4Department of International Health, Immunology & Microbiology, Centre for Medical Parasitology, University of Copenhagen, Copenhagen, Denmark 5Department of Infectious Diseases, Rigshospitalet, Copenhagen, Denmark 6Blantyre Malaria Project, College of Medicine, University of Malawi, Blantyre, Malawi 7Department of Osteopathic Medical Specialties, College of Osteopathic Medicine, Michigan State University, East Lansing, MI, USA 8Institute of Infection and Global Health, University of Liverpool, Liverpool, UK 9Wellcome Centre for Molecular Parasitology, Institute of Infection, Immunity and Inflammation, College of Medical Veterinary & Life Sciences, University of Glasgow, Glasgow, UK *Corresponding author. Tel: +44 151 705 3297; E-mail: [email protected] *Corresponding author. Tel: +44 151 705 3161; E-mail: [email protected] EMBO Mol Med (2019)11:e9164https://doi.org/10.15252/emmm.201809164 PDFDownload PDF of article text and main figures. Peer ReviewDownload a summary of the editorial decision process including editorial decision letters, reviewer comments and author responses to feedback. ToolsAdd to favoritesDownload CitationsTrack CitationsPermissions ShareFacebookTwitterLinked InMendeleyWechatReddit Figures & Info Abstract Sequestration of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes (IE) within the brain microvasculature is a hallmark of cerebral malaria (CM). Using a microchannel flow adhesion assay with TNF-activated primary human microvascular endothelial cells, we demonstrate that IE isolated from Malawian paediatric CM cases showed increased binding to brain microvascular endothelial cells compared to IE from uncomplicated malaria (UM) cases. Further, UM isolates showed significantly greater adhesion to dermal than to brain microvascular endothelial cells. The major mediator of parasite adhesion is P. falciparum erythrocyte membrane protein 1, encoded by var genes. Higher levels of var gene transcripts predicted to bind host endothelial protein C receptor (EPCR) and ICAM-1 were detected in CM isolates. These data provide further evidence for differential tissue binding in severe and uncomplicated malaria syndromes, and give additional support to the hypothesis that CM pathology is based on increased cytoadherence of IE in the brain microvasculature. Synopsis Cytoadherence of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes (IE) to the endothelial cells lining brain vessels is a hallmark of cerebral malaria (CM). This study shows that the ability of IE to cytoadhere in the brain of patients with CM and uncomplicated malaria is associated with the disease. IE from children with uncomplicated malaria do not bind well to brain endothelial cells, whereas IE from CM patients show high levels of binding. Significant associations in IE binding to brain endothelial cells were seen for both ICAM-1 and EPCR. PfEMP1 variants containing EPCR-binding motifs were associated with cerebral malaria. Introduction Despite the significant reductions in mortality and morbidity of malaria in the last decade, the percentage of patients infected with Plasmodium falciparum that succumb to severe malaria (SM) is not changing (WHO, 2017), with cerebral malaria (CM) contributing to much of the mortality. The overall mortality rate for CM in children is 15–25%, with a recent MRI study showing that brain swelling is strongly associated with fatal outcome in CM (Seydel et al, 2015). The pathology of CM has been studied extensively (Idro et al, 2005; Hawkes et al, 2013) but also debated for many decades, as discussed in numerous reviews (Shikani et al, 2012; Cunnington et al, 2013; Storm & Craig, 2014; Wassmer & Grau, 2017). What is clear is that the pathogenesis is multifactorial, with a role for the immune response to the Plasmodium infection (Hunt & Grau, 2003; Ioannidis et al, 2014; Dieye et al, 2016; Mandala et al, 2017; Wolf et al, 2017) and obstruction of the microvasculature by sequestration and rosetting (Rowe et al, 2009; Craig et al, 2012; Ponsford et al, 2012; White et al, 2013; Milner et al, 2015), leading to endothelial dysfunction. Sequestration of P. falciparum-infected erythrocytes (IE) in brain microvasculature is a hallmark of human CM as shown in post-mortem studies (Pongponratn et al, 1991; Taylor et al, 2004), but whether this sequestration is due to differential binding of IE to brain endothelium has been harder to demonstrate. The major mediator of parasite cytoadherence to endothelium is P. falciparum erythrocyte membrane protein 1 (PfEMP1), a variant surface antigen expressed on knobs on the IE surface and encoded by approximately 60 var genes per parasite genome, with only one PfEMP1 being expressed on the surface of any individual IE (Scherf et al, 2008; Pasternak & Dzikowski, 2009). PfEMP1 is composed of multiple Duffy binding-like (DBL) and cysteine-rich interdomain region (CIDR) domains and can be classified into four main groups A, B, C and E based on the 5′ upstream sequence of the encoding var gene (Fig 1; Smith, 2014). PfEMP1 binds to a range of receptors and includes the mutually exclusive CD36 and endothelial protein C receptor (EPCR)-binding phenotypes, mediated by N-terminal CIDR domains (Kraemer & Smith, 2006; Semblat et al, 2006, 2015; Rask et al, 2010; Hviid & Jensen, 2015). Approximately half of group A PfEMP1 and a subset of group B/A chimeric PfEMP1, also known as domain cassette 8 (DC8), bind to EPCR via CIDRα1 domains, whereas group B and C PfEMP1 bind CD36 via CIDRα2-CIDRα6 domains. In addition, binding to intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) is mediated via DBLβ domains adjacent to the CIDR domains and in some cases has been associated with a dual-binding phenotype with EPCR (Lennartz et al, 2017). Figure 1. PfEMP1 domain structureA schematic presentation of PfEMP1 domain structure comprising a N-terminal head structure, 2-6 subsequent C-terminal domains, a transmembrane domain (TM) and an intracellular acidic terminal segment (ATS) with known receptors indicated in bold. Receptor specificity is determined by combined DBL and CIDR domains with mutually exclusive binding to EPCR and CD36 by different CIDRα domains in the head structure. Part of group A PfEMP1 and a particular subset of group B/A chimeric PfEMP1 (DC8) bind to EPCR via CIDRα1 domains, whereas group B and C PfEMP1 bind CD36 via CIDRα2-6 domains. The atypical group E VAR2CSA PfEMP1 binds placental chondroitin sulphate A (CSA) via DBLpam1 and DBLpam2 domains. The binding phenotype of VAR 1, VAR3 and group A CIDRβ/γ/δ domains is unknown, but they do not bind EPCR or CD36. DBLβ domains can be involved in ICAM-1 binding and are from both groups A and B. Not much is known about the other DBL domains (γ/δ/ε/ζ), but the DBLε and DBLζ domains are implicated in IgM and α2-macroglobulin binding. Download figure Download PowerPoint In choosing which host receptors to study, we took into account the findings that categories of PfEMP1 types are also associated with in vivo expression in SM. A particularly strong example of this is where parasites expressing var genes encoding PfEMP1 containing EPCR-binding domains have shown a strong association with the development of SM, including CM (Avril et al, 2012; Claessens et al, 2012; Lavstsen et al, 2012; Bengtsson et al, 2013; Bertin et al, 2013; Jespersen et al, 2016; Kessler et al, 2017; Mkumbaye et al, 2017). In vitro, parasites expressing EPCR-binding PfEMP1 show greater degrees of binding to EPCR, as well as to ICAM-1 receptors, both of which are expressed on brain microvascular endothelium (Turner et al, 2013; Avril et al, 2016; Lennartz et al, 2017). ICAM-1 binding has been mapped to some, but not all, DBLβ domains found adjacent to the N-terminal CIDR domains in about one-third of all PfEMP1. A subset of ICAM-1-binding DBLβ domains were recently shown to be specific for group A EPCR-binding PfEMP1 and found to be expressed at higher levels in parasites from CM patients than in parasites from non-CM patients (Lennartz et al, 2017). Parasites expressing CD36-binding PfEMP1 are found in many patient isolates regardless of symptoms, although some data suggest that they may constitute a smaller proportion of parasites in SM patients (Heddini et al, 2001; Ndam et al, 2017), and are not seen in parasite isolates taken from women with placental malaria (Smith et al, 2013). Several other host receptors for PfEMP1 have been described, however, while PfEMP1 proteins that bind these receptors have been identified (Berger et al, 2013), links between cytoadherence and paediatric CM have not been established, and these were not tested in our study. Infected erythrocytes binding to specific receptors during an infection may have different functional consequences on the endothelium and hence on disease severity. One clear example is that by binding to EPCR, the IE interfere with production of activated protein C thereby launching the coagulation cascade, leading to increased thrombin production (Moxon et al, 2013) and the potential to cause pro-inflammatory PAR1-mediated endothelial activation (Petersen et al, 2015; Gillrie et al, 2016). Other PfEMP1-receptor interactions have been shown to activate signalling pathways in endothelial cells (Wu et al, 2011; Gillrie & Ho, 2017), but the effect of these events on pathology is unclear. More recent work has also suggested that as well as cytoadherence-mediated events, the accumulation of sequestered IE in vessels may facilitate endothelial dysfunction caused by the local release of soluble mediators following schizont rupture (Gallego-Delgado & Rodriguez, 2017). Thus, it remains unclear why a particular child develops CM at a particular time, as the vast majority of P. falciparum infections do not lead to CM. In addition, most African children who develop CM have had malaria previously without developing CM. One possible mechanism to explain why a child develops CM at a particular time is that they have been infected with a P. falciparum variant that facilitates recruitment of IE to endothelium in the brain. While multiple lines of evidence indicate that specific PfEMP1 variants are associated with severe malaria, that association has not been substantiated by directly measuring the binding of IE to endothelial cells (EC). Thus, the question as to whether IE from children with CM have cytoadherence properties that enable them to bind to brain endothelium and thus enhancing their sequestration in that site has not been tested. The extent of sequestration in the brain is unknown for non-CM cases, although post-mortem observations of brain vessels from malaria-infected children dying from other causes of coma (not CM) show much lower levels of IE sequestration than CM cases (Milner et al, 2015). Therefore, as a comparison, isolates from children with uncomplicated malaria (UM) have also been tested for their binding phenotype in the present study. A number of studies have investigated cytoadherence of specific PfEMP1 variants to human microvascular endothelial cells, but these have been with laboratory strains or PfEMP1-modified parasites (Madkhali et al, 2014; Gillrie et al, 2015). Patient isolates have also been investigated for their binding phenotype, but mainly on purified protein and mostly under static conditions (Craig et al, 2012; Almelli et al, 2014; Mahamar et al, 2017; Ndam et al, 2017). While providing important evidence, these studies were unable, largely for technical reasons, to combine the most appropriate target (primary brain endothelium) and parasite isolates as close to the patient sample as possible, with a physiologically relevant assay. To address our hypothesis that CM is driven by increased binding of IE to brain endothelium, we assessed whether IE freshly isolated from circulating blood of children with CM preferentially bound TNF-activated primary brain microvascular endothelium, compared to IE isolated from UM children. We postulated that such a difference might be associated with the expression of particular PfEMP1 variants and with binding to specific endothelial receptors. We collected IE from carefully characterised paediatric CM and UM cases in Malawi and determined cytoadherence to primary human microvascular endothelial cells, with minimal in vitro expansion of the parasite population, using a microfluidic flow device, an experimental design reflecting in vivo physiology. Expression of PfEMP1 variants was investigated by qPCR using the most up-to-date set of var domain type-specific primers available to us. To our knowledge, this study is the first study to employ such a comprehensive approach to address the question of whether cytoadherence is involved in the pathogenesis of CM. Results Recruitment of study participants Children were recruited over three malaria seasons from 2013 to 2015 using the selection criteria described in the Materials and Methods section. Total CM cases admitted to the research ward have been decreasing since 2010, from 165 cases to 48 (18) cases in 2013, 78 (26) in 2014 and 43 (14) in 2015. Numbers in brackets are the recruited number of children for our cytoadherence study. To improve the specificity of the clinical diagnosis of CM, only children with at least one feature of malarial retinopathy (Maccormick et al, 2014) were included, resulting in the recruitment of a total of 58 cases. A total of 53 UM cases, matched on an annual basis to the number of CM cases, were included. Clinical characteristics of the total UM and CM cohorts and the cases used for experiments are summarised in Table 1. The median age of children with UM was higher than children with CM. Compared to children with UM, children with CM had significantly higher median pulse and respiratory rates, higher median lactate concentration and lower median haematocrit levels, indicators of severe disease (WHO, 2016). Ten of the children with CM (17%) died. To achieve 2% parasitaemia needed for the cytoadherence assays, only blood samples from children with at least 2% peripheral parasitaemia were utilised. The clinical characteristics of these selected cases were similar to the overall cohort of children with each of these clinical syndromes. Table 1. Clinical characteristics of the study participants Total cohort uncomplicated malaria (n = 53) Total cohort cerebral malaria (n = 60) P-value Used in assay uncomplicated malaria (n = 35) Used in assay cerebral malaria (n = 27) P-value Age, months 51 (30–74) 42 (24–59) 0.04 53 (38–89) 36 (23–50) 0.005 Gender, % female 53 47 51 48 Axillary temperature, °C 38.8 (38.2–39.4) 39.0 (38.1–40.0) 38.8 (381–39.4) 39.0 (37.9–40.0) Pulse rate, beats/min 124 (107–140) 157 (140–175) < 0.0001 124 (114–146) 156 (133–175) 0.0001 Systolic blood pressure, mmHg 98 (91–102) 95 (86–104)a 97 (91–99) 94 (85–103)b Respiratory rate, breaths/min 30 (25–30) 40 (36–52) < 0.0001 28 (24–30) 41 (32–52) < 0.0001 Blood glucose, mmol/l 5.7 (5.1–6.4) 5.4 (4.4–6.8) 5.8 (5.1–6.5) 5.0 (4.5–6.7) Blood lactate, mmol/l 2.9 (2.0–3.4) 4.5 (2.4–8.8) < 0.0001 2.9 (1.9–3.5) 4.6 (2.3–8.2) 0.0006 Haematocrit, % 35.0 (30.0–38.0) 22.0 (18.0–25.6) < 0.0001 36.0 (29.5–38.0) 20.4 (16.8–25.1) < 0.0001 HRP2, μg/ml 7.1 (2.2–9.9)c 9.5 (3.1–11.0)d Parasitaemia, parasites/μl (×104) 11.8 (4.2–38.4) 29.8 (14.6–59.9) Platelets/μl (×104) 4.9 (2.4–9.6)c 4.9 (2.4–9.8)d Shown are the median with the interquartile range in brackets for the total cohort and the cases used in the binding assays. For each variable, statistical differences between UM and CM cases were determined by Mann–Whitney U-test (continuous variables) or Fisher's exact test (categorical variables), and P-values < 0.05 are indicated. HRP2 = histidine-rich protein 2. Group size in a = 50, b = 21, c = 55 and d = 24 children. Cytoadherence of clinical isolates to microvascular endothelial cells under flow Isolated IE were cultured until the parasites were at the trophozoite stage, when PfEMP1 is expressed on the surface of the IE, and a suspension of 2% parasitaemia and 5% haematocrit was prepared. Using the microfluidic device, cytoadherence to primary human microvascular endothelial cells, derived from brain (HBMEC) and dermis (HDMEC), was determined under flow conditions. Isolates from CM cases demonstrated an average binding of 110 IE/mm2 (95% CI: 37–182) to HBMEC which was significantly higher (P = 0.041) than HBMEC binding of UM cases at 43 IE/mm2 (95% CI: 28–57; Fig 2). In contrast, there was no difference in binding to HDMEC (P = 0.171) between IE from CM cases (average 165 IE/mm2, 95% CI: 81–250) and UM cases (average 110 IE/mm2, 95% CI: 71–149). Binding of UM isolates to HBMEC was significantly lower compared to HDMEC (P = 0.002), which was not the case for CM isolates. For isolates from CM patients, avid binding was a common feature; isolates that bound well to HBMEC also bound well to HDMEC with a Spearman's correlation coefficient of 0.83 (P < 0.0001). For UM isolates, however, there was no correlation between binding to HBMEC and HDMEC (r = 0.20, P = 0.28). A recent publication by Azasi et al (2018b) showed that DC8-PfEMP1 expressing IE do not bind EPCR in the presence of normal human serum. Therefore, we tested whether adding 10% human serum to the binding buffer would decrease the cytoadherence of selected patient isolates to HBMEC (Appendix Fig S2). Human serum did not change the binding of three patient isolates that showed significant EPCR binding to HBMEC. The binding of DC8 variant IT4var19 was also not affected by the addition of human serum in our flow assay system. Figure 2. Cytoadherence of IE from CM and UM cases to HBMEC and HDMECIE were isolated, and binding to HBMEC and HDMEC was determined under flow conditions. Number of IE bound per mm2 EC surface was calculated and shown is the mean ± 95% CI for 26 CM and 33 UM cases on HBMEC and 21 CM and 35 UM cases on HDMEC on a log scale. P-value was calculated by two-tailed unpaired t-test. The dotted line is 20 IE/mm2, the cut-off value for inclusion of the inhibition data. Download figure Download PowerPoint Inhibition of cytoadherence to microvascular endothelial cells under flow To assess the differential role of the endothelial receptors ICAM-1, EPCR and CD36, binding was determined in the presence of inhibitory antibodies, αICAM-1 and αCD36, or recombinant protein, rEPCR (Fig 3). Paired analysis of the inhibition binding data is shown in Fig 3A and significant inhibition was observed for all the EC-inhibitor combinations, except for inhibition of binding of UM isolates to HDMEC by rEPCR. The data are summarised as percentage inhibition in Fig 3B–D, to compare receptor-dependent adherence between CM and UM. Approximately half of the IE displayed ICAM-1-dependent binding (> 50% inhibition) to both HBMEC and HDMEC, but there was no significant difference between CM and UM isolates nor between the dependency of ICAM-1 binding to HBMEC and HDMEC. CD36 expression is extremely low on primary HBMEC (Avril et al, 2016), so studies on binding to CD36 were only performed with HDMEC. Inhibition of cytoadherence by αCD36 antibody was variable and not significantly different between the CM and UM isolates (P = 0.23), although there was a trend for higher CD36-dependent binding in UM isolates. EPCR-dependent binding also varied, with a subset of isolates binding particularly well to EPCR. This was more pronounced for CM isolates binding to HBMEC, but not significantly different from UM isolates (P = 0.073). There was also no significant difference between rEPCR inhibition of binding to HBMEC and HDMEC. For a few isolates, there was more binding in the presence of αICAM-1 antibody or rEPCR compared to binding in the absence of inhibitor (Fig 3B and D), and this was more often the case for UM isolates. The reason for this is unclear; we were unable to collect the bound IE to investigate this phenomenon further. Figure 3. Inhibition of cytoadherence of IE from CM and UM cases to HDMEC and HBMEC by αICAM-1 and αCD36 antibody and rEPCR† A. IE were isolated, and binding to HBMEC and HDMEC was determined under flow conditions in the absence and presence of 5 μg/ml αICAM-1 or αCD36 antibody or 50 μg/ml rEPCR. Number of IE bound per mm2 EC surface was determined. B. Using the same data, percentage inhibition by αICAM-1 antibody was calculated relatively to binding in the absence of antibody. C. Using the same data, percentage inhibition by rEPCR was calculated relatively to binding in the absence of inhibitor. D. Using the same data, percentage inhibition by αCD36 antibody was calculated relatively to binding in the absence of antibody. Data information: (A) shown is the paired analysis between the absence and presence of inhibitor, with number of cases (n) indicated. Statistical significance was determined by two-tailed paired t-test, and the P-value is shown; ns is not significant. (B–D) shown are the mean ± 95% CI, and no significant differences were determined with a two-tailed unpaired t-test. Each assay was only conducted once for each isolate. The number of isolates tested can be seen from the dot plot. Download figure Download PowerPoint Correlations between IE binding and clinical parameters We assessed the association between the in vitro cytoadherence properties of the IE and clinical parameters associated with sequestration. For the CM cases, the degree of IE binding to HDMEC was positively correlated with peripheral parasite density at recruitment (r = 0.56, P = 0.011). Binding of IE to HBMEC was less clearly associated with peripheral parasite density (r = 0.40, P = 0.056). Differences in levels of binding were not due to variation in parasitaemia of the cultured IE, as the binding assay was performed at a standardised 2% parasitaemia. Binding of CM isolates was negatively correlated with peripheral platelet levels for both binding to HDMEC (r = −0.66, P = 0.001) and HBMEC (r = −0.56, P = 0.005). We were unable to assess the association between IE adhesion and fatal outcome as only three children for whom we had binding data died. None of the other clinical characteristics, including histidine-rich protein 2 concentrations, showed any significant correlation with the cytoadherence of IE. For the UM cases, none of the parameters assessed were significantly correlated with cytoadherence. Peripheral parasite density (as per WHO standard) and platelet counts were not determined at admission in UM cases; however, after processing the UM blood samples, parasitaemia was determined by microscopy of Giemsa-stained smears and no correlation was found between parasitaemia and binding intensity. Analysis of var gene transcripts To analyse the PfEMP1 domain structure (Fig 1) of the patient isolates, transcript levels of the coding var genes were determined. qPCR was performed and var transcript values (Tu) were calculated and compared between CM and UM cases (Table 2). A detailed description of coverage, sensitivity and limitati<br/>
SUPPLEMENTAL MATERIAL
Coming soon ....
REFERENCES (94)
CITATIONS (96)
EXTERNAL LINKS
PlumX Metrics
RECOMMENDATIONS
FAIR ASSESSMENT
Coming soon ....
JUPYTER LAB
Coming soon ....