Structural Analysis and Involvement in Plant Innate Immunity of Xanthomonas axonopodis pv. citri Lipopolysaccharide

• DOI: 10.1074/jbc.m110.186049
• Publication Date: 2011-05-20T00:47:07Z
• Authors: Adriana Casabuono; Silvana Petrocelli; Jorgelina Ottado; Elena G. Orellano; Alicia S. Couto
• Keywords: Lipopolysaccharides; Mechanisms of Plant Immune Response; 0301 basic medicine; Xanthomonas; Molecular Sequence Data; Lipopolysaccharide; Plant Science; Microbiology; Rhamnose; Biochemistry; Gene; Oligosaccharide; Agricultural and Biological Sciences; 03 medical and health sciences; Endocrinology; Bacterial Proteins; Gene Expression Regulation, Plant; Symbiotic Nitrogen Fixation in Legumes; Plant Immunity; Biology; Pathogen; Genomics and Pathogenicity of Plant Pathogenic Bacteria; Mutant; Life Sciences; Immunity, Innate; Peroxides; Plant Leaves; Chemistry; Lipid A; Carbohydrate Sequence; FOS: Biological sciences; Host-Pathogen Interactions; Plant Stomata; Xanthomonas axonopodis; ATP-Binding Cassette Transporters; Mannose; Citrus sinensis

Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) provoca el cancro de los cítricos, provocando la defoliación y la caída prematura de la fruta con daños económicos concomitantes. En las bacterias patógenas de las plantas, los lipopolisacáridos son factores de virulencia importantes y se reconocen cada vez más como los principales patrones moleculares asociados a patógenos para las plantas. En general, se reconocen tres dominios en un lipopolisacárido: el lípido A hidrófobo, el polisacárido de antígeno O hidrófilo y el oligosacárido central, que conecta el lípido A y el antígeno O. En este trabajo, hemos determinado la estructura de lipopolisacáridos purificados obtenidos de Xanthomonas axonopodis pv. citri de tipo salvaje y un mutante del transportador ABC del antígeno O codificado por el gen wzt. Se realizó cromatografía de intercambio aniónico de alto pH y análisis de espectro de masas de desorción/ionización láser asistida por matriz, lo que permitió la determinación de la estructura no solo de los oligosacáridos liberados y los restos de lípido A, sino también de los lipopolisacáridos intactos. Los resultados demuestran que los LPS de Xac de tipo salvaje y Xacwzt se componen principalmente de una estructura principal de diglucosamina penta o tetraacilada unida a dos grupos pirofosforiletanolamina o a un grupo pirofosforiletanolamina y un grupo fosforiletanolamina. La región central consiste en un oligosacárido ramificado formado por Kdo2Hex6GalA3Fuc3NAcRha4 y dos grupos fosfato. Como se esperaba, la presencia de un homooligosacárido de ramnosa como antígeno O se determinó solo en el lipopolisacárido de tipo salvaje Xac. Además, hemos examinado cómo funcionan los lipopolisacáridos de Xac en el proceso de patogénesis. Analizamos la respuesta de los diferentes lipopolisacáridos durante el ciclo de cierre de la abertura de los estomas, la deposición de callosa, la expresión de genes relacionados con la defensa y la producción de especies reactivas de oxígeno en las hojas de los cítricos, lo que sugiere un papel funcional del antígeno O de los lipopolisacáridos Xac en la respuesta basal. Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) provoca el cancro de los cítricos, provocando la defoliación y la caída prematura de la fruta con daños económicos concomitantes. En las bacterias patógenas de las plantas, los lipopolisacáridos son factores de virulencia importantes y se reconocen cada vez más como los principales patrones moleculares asociados a patógenos para las plantas. En general, se reconocen tres dominios en un lipopolisacárido: el lípido A hidrófobo, el polisacárido de antígeno O hidrófilo y el oligosacárido central, que conecta el lípido A y el antígeno O. En este trabajo, hemos determinado la estructura de lipopolisacáridos purificados obtenidos de Xanthomonas axonopodis pv. citri de tipo salvaje y un mutante del transportador ABC del antígeno O codificado por el gen wzt. Se realizó cromatografía de intercambio aniónico de alto pH y análisis de espectro de masas de desorción/ionización láser asistida por matriz, lo que permitió la determinación de la estructura no solo de los oligosacáridos liberados y los restos de lípido A, sino también de los lipopolisacáridos intactos. Los resultados demuestran que los LPS de Xac de tipo salvaje y Xacwzt se componen principalmente de una estructura principal de diglucosamina penta o tetraacilada unida a dos grupos pirofosforiletanolamina o a un grupo pirofosforiletanolamina y un grupo fosforiletanolamina. La región central consiste en un oligosacárido ramificado formado por Kdo2Hex6GalA3Fuc3NAcRha4 y dos grupos fosfato. Como se esperaba, la presencia de un homooligosacárido de ramnosa como antígeno O se determinó solo en el lipopolisacárido de tipo salvaje Xac. Además, hemos examinado cómo funcionan los lipopolisacáridos de Xac en el proceso de patogénesis. Analizamos la respuesta de los diferentes lipopolisacáridos durante el ciclo de cierre de la abertura de los estomas, la deposición de callosa, la expresión de genes relacionados con la defensa y la producción de especies reactivas de oxígeno en las hojas de los cítricos, lo que sugiere un papel funcional del antígeno O de los lipopolisacáridos Xac en la respuesta basal.<br/>Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) causes citrus canker, provoking defoliation and premature fruit drop with concomitant economical damage. In plant pathogenic bacteria, lipopolysaccharides are important virulence factors, and they are being increasingly recognized as major pathogen-associated molecular patterns for plants. In general, three domains are recognized in a lipopolysaccharide: the hydrophobic lipid A, the hydrophilic O-antigen polysaccharide, and the core oligosaccharide, connecting lipid A and O-antigen. In this work, we have determined the structure of purified lipopolysaccharides obtained from Xanthomonas axonopodis pv. citri wild type and a mutant of the O-antigen ABC transporter encoded by the wzt gene. High pH anion exchange chromatography and matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrum analysis were performed, enabling determination of the structure not only of the released oligosaccharides and lipid A moieties but also the intact lipopolysaccharides. The results demonstrate that Xac wild type and Xacwzt LPSs are composed mainly of a penta- or tetra-acylated diglucosamine backbone attached to either two pyrophosphorylethanolamine groups or to one pyrophosphorylethanolamine group and one phosphorylethanolamine group. The core region consists of a branched oligosaccharide formed by Kdo2Hex6GalA3Fuc3NAcRha4 and two phosphate groups. As expected, the presence of a rhamnose homo-oligosaccharide as O-antigen was determined only in the Xac wild type lipopolysaccharide. In addition, we have examined how lipopolysaccharides from Xac function in the pathogenesis process. We analyzed the response of the different lipopolysaccharides during the stomata aperture closure cycle, the callose deposition, the expression of defense-related genes, and reactive oxygen species production in citrus leaves, suggesting a functional role of the O-antigen from Xac lipopolysaccharides in the basal response. Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) causes citrus canker, provoking defoliation and premature fruit drop with concomitant economical damage. In plant pathogenic bacteria, lipopolysaccharides are important virulence factors, and they are being increasingly recognized as major pathogen-associated molecular patterns for plants. In general, three domains are recognized in a lipopolysaccharide: the hydrophobic lipid A, the hydrophilic O-antigen polysaccharide, and the core oligosaccharide, connecting lipid A and O-antigen. In this work, we have determined the structure of purified lipopolysaccharides obtained from Xanthomonas axonopodis pv. citri wild type and a mutant of the O-antigen ABC transporter encoded by the wzt gene. High pH anion exchange chromatography and matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrum analysis were performed, enabling determination of the structure not only of the released oligosaccharides and lipid A moieties but also the intact lipopolysaccharides. The results demonstrate that Xac wild type and Xacwzt LPSs are composed mainly of a penta- or tetra-acylated diglucosamine backbone attached to either two pyrophosphorylethanolamine groups or to one pyrophosphorylethanolamine group and one phosphorylethanolamine group. The core region consists of a branched oligosaccharide formed by Kdo2Hex6GalA3Fuc3NAcRha4 and two phosphate groups. As expected, the presence of a rhamnose homo-oligosaccharide as O-antigen was determined only in the Xac wild type lipopolysaccharide. In addition, we have examined how lipopolysaccharides from Xac function in the pathogenesis process. We analyzed the response of the different lipopolysaccharides during the stomata aperture closure cycle, the callose deposition, the expression of defense-related genes, and reactive oxygen species production in citrus leaves, suggesting a functional role of the O-antigen from Xac lipopolysaccharides in the basal response.<br/>Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) provoque un chancre des agrumes, provoquant une défoliation et une chute prématurée des fruits avec des dommages économiques concomitants. Chez les bactéries pathogènes des plantes, les lipopolysaccharides sont des facteurs de virulence importants, et ils sont de plus en plus reconnus comme des modèles moléculaires majeurs associés aux agents pathogènes pour les plantes. En général, trois domaines sont reconnus dans un lipopolysaccharide : le lipide hydrophobe A, le polysaccharide O-antigène hydrophile et l'oligosaccharide de base, reliant le lipide A et l'O-antigène. Dans ce travail, nous avons déterminé la structure de lipopolysaccharides purifiés obtenus à partir de Xanthomonas axonopodis pv. citri de type sauvage et d'un mutant du transporteur ABC de l'antigène O codé par le gène wzt. Une chromatographie d'échange d'anions à pH élevé et une analyse du spectre de masse par désorption/ionisation laser assistée par matrice ont été effectuées, permettant de déterminer la structure non seulement des oligosaccharides libérés et des fractions lipidiques A, mais également des lipopolysaccharides intacts. Les résultats démontrent que les LPS de type sauvage Xac et Xacwzt sont principalement composés d'un squelette de diglucosamine penta- ou tétra-acylée attaché soit à deux groupes pyrophosphoryléthanolamine, soit à un groupe pyrophosphoryléthanolamine et un groupe phosphoryléthanolamine. La région centrale se compose d'un oligosaccharide ramifié formé par Kdo2Hex6GalA3Fuc3NAcRha4 et deux groupes phosphate. Comme prévu, la présence d'un homo-oligosaccharide de rhamnose en tant qu'antigène O n'a été déterminée que dans le lipopolysaccharide de type sauvage Xac. De plus, nous avons examiné comment les lipopolysaccharides de Xac fonctionnent dans le processus de pathogenèse. Nous avons analysé la réponse des différents lipopolysaccharides au cours du cycle de fermeture de l'ouverture des stomates, le dépôt de callose, l'expression de gènes liés à la défense et la production d'espèces réactives de l'oxygène dans les feuilles d'agrumes, suggérant un rôle fonctionnel de l'antigène O des lipopolysaccharides Xac dans la réponse basale. Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) provoque un chancre des agrumes, provoquant une défoliation et une chute prématurée des fruits avec des dommages économiques concomitants. Chez les bactéries pathogènes des plantes, les lipopolysaccharides sont des facteurs de virulence importants, et ils sont de plus en plus reconnus comme des modèles moléculaires majeurs associés aux agents pathogènes pour les plantes. En général, trois domaines sont reconnus dans un lipopolysaccharide : le lipide hydrophobe A, le polysaccharide O-antigène hydrophile et l'oligosaccharide de base, reliant le lipide A et l'O-antigène. Dans ce travail, nous avons déterminé la structure de lipopolysaccharides purifiés obtenus à partir de Xanthomonas axonopodis pv. citri de type sauvage et d'un mutant du transporteur ABC de l'antigène O codé par le gène wzt. Une chromatographie d'échange d'anions à pH élevé et une analyse du spectre de masse par désorption/ionisation laser assistée par matrice ont été effectuées, permettant de déterminer la structure non seulement des oligosaccharides libérés et des fractions lipidiques A, mais également des lipopolysaccharides intacts. Les résultats démontrent que les LPS de type sauvage Xac et Xacwzt sont principalement composés d'un squelette de diglucosamine penta- ou tétra-acylée attaché soit à deux groupes pyrophosphoryléthanolamine, soit à un groupe pyrophosphoryléthanolamine et un groupe phosphoryléthanolamine. La région centrale se compose d'un oligosaccharide ramifié formé par Kdo2Hex6GalA3Fuc3NAcRha4 et deux groupes phosphate. Comme prévu, la présence d'un homo-oligosaccharide de rhamnose en tant qu'antigène O n'a été déterminée que dans le lipopolysaccharide de type sauvage Xac. De plus, nous avons examiné comment les lipopolysaccharides de Xac fonctionnent dans le processus de pathogenèse. Nous avons analysé la réponse des différents lipopolysaccharides au cours du cycle de fermeture de l'ouverture des stomates, le dépôt de callose, l'expression de gènes liés à la défense et la production d'espèces réactives de l'oxygène dans les feuilles d'agrumes, suggérant un rôle fonctionnel de l'antigène O des lipopolysaccharides Xac dans la réponse basale.<br/>يتسبب Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) في الإصابة بقرحة الحمضيات، مما يؤدي إلى إزالة الأوراق وقطرة الفاكهة المبكرة مع ما يصاحب ذلك من أضرار اقتصادية. في البكتيريا المسببة للأمراض النباتية، تعد عديدات السكاريد الشحمية من عوامل الفوعة المهمة، ويتم التعرف عليها بشكل متزايد على أنها أنماط جزيئية رئيسية مرتبطة بمسببات الأمراض للنباتات. بشكل عام، يتم التعرف على ثلاثة مجالات في عديد السكاريد الشحمي: الدهون A غير الآلفة للماء، وعديد السكاريد O - antigen الآلف للماء، والقليل السكاريد الأساسي، الذي يربط الدهون A و O - antigen. في هذا العمل، حددنا بنية عديد السكاريد الشحمي المنقى الذي تم الحصول عليه من Xanthomonas axonopodis pv. citri wild type and a mutant of the O - antigen ABC transporter encoded by the wzt gen. تم إجراء تحليل كروماتوغرافي عالي التبادل الأنيوني الأس الهيدروجيني وتحليل الطيف الكتلي للامتصاص بالليزر بمساعدة المصفوفة/التأين، مما يتيح تحديد بنية ليس فقط السكريات القليلة المنبعثة وشظايا الدهون A ولكن أيضًا السكريات الدهنية السليمة. تظهر النتائج أن النوع البري Xac و Xacwzt LPSs يتكونان بشكل أساسي من عمود فقري ثنائي الجلوكوزامين خماسي أو رباعي الأسيتات مرتبط إما بمجموعتين من البيروفوسفوريليثانولامين أو بمجموعة واحدة من البيروفوسفوريليثانولامين ومجموعة واحدة من الفوسفوريليثانولامين. تتكون المنطقة الأساسية من أوليجو سكاريد متفرع يتكون من Kdo2Hex6GalA3Fuc3NAcRha4 ومجموعتين من الفوسفات. كما هو متوقع، تم تحديد وجود رامنوز هومو أوليجو سكاريد كمستضد O فقط في عديد السكاريد الشحمي من نوع Xac البري. بالإضافة إلى ذلك، قمنا بفحص كيفية عمل عديدات السكاريد الدهنية من Xac في عملية التسبب في المرض. قمنا بتحليل استجابة السكريات الدهنية المختلفة خلال دورة إغلاق فتحة الفم، وترسب الكالوز، والتعبير عن الجينات المرتبطة بالدفاع، وإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية في أوراق الحمضيات، مما يشير إلى دور وظيفي للمستضد O من السكريات الدهنية Xac في الاستجابة القاعدية. يتسبب Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac) في الإصابة بقرحة الحمضيات، مما يؤدي إلى إزالة الأوراق وقطرة الفاكهة المبكرة مع ما يصاحب ذلك من أضرار اقتصادية. في البكتيريا المسببة للأمراض النباتية، تعد عديدات السكاريد الشحمية من عوامل الفوعة المهمة، ويتم التعرف عليها بشكل متزايد على أنها أنماط جزيئية رئيسية مرتبطة بمسببات الأمراض للنباتات. بشكل عام، يتم التعرف على ثلاثة مجالات في عديد السكاريد الشحمي: الدهون A غير الآلفة للماء، وعديد السكاريد O - antigen الآلف للماء، والقليل السكاريد الأساسي، الذي يربط الدهون A و O - antigen. في هذا العمل، حددنا بنية عديد السكاريد الشحمي المنقى الذي تم الحصول عليه من Xanthomonas axonopodis pv. citri wild type and a mutant of the O - antigen ABC transporter encoded by the wzt gen. تم إجراء تحليل كروماتوغرافي عالي التبادل الأنيوني الأس الهيدروجيني وتحليل الطيف الكتلي للامتصاص بالليزر بمساعدة المصفوفة/التأين، مما يتيح تحديد بنية ليس فقط السكريات القليلة المنبعثة وشظايا الدهون A ولكن أيضًا السكريات الدهنية السليمة. تظهر النتائج أن النوع البري Xac و Xacwzt LPSs يتكونان بشكل أساسي من عمود فقري ثنائي الجلوكوزامين خماسي أو رباعي الأسيتات مرتبط إما بمجموعتين من البيروفوسفوريليثانولامين أو بمجموعة واحدة من البيروفوسفوريليثانولامين ومجموعة واحدة من الفوسفوريليثانولامين. تتكون المنطقة الأساسية من أوليجو سكاريد متفرع يتكون من Kdo2Hex6GalA3Fuc3NAcRha4 ومجموعتين من الفوسفات. كما هو متوقع، تم تحديد وجود رامنوز هومو أوليجو سكاريد كمستضد O فقط في عديد السكاريد الشحمي من نوع Xac البري. بالإضافة إلى ذلك، قمنا بفحص كيفية عمل عديدات السكاريد الدهنية من Xac في عملية التسبب في المرض. قمنا بتحليل استجابة عديدات السكاريد الدهنية المختلفة خلال دورة إغلاق فتحة الفم، وترسب الكالوز، والتعبير عن الجينات المرتبطة بالدفاع، وإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية في أوراق الحمضيات، مما يشير إلى دور وظيفي للمستضد O من عديدات السكاريد الدهنية Xac في الاستجابة القاعدية.<br/>