Insights into the evolution of enzyme substrate promiscuity after the discovery of (βα)8 isomerase evolutionary intermediates from a diverse metagenome

• DOI: 10.1186/s12862-015-0378-1
• Publication Date: 2015-06-11T05:09:39Z
• Authors: Lianet Noda-García; Ana L. Juárez-Váz...; María C. Ávila-Arcos; Ernesto A. Verduz...; Gabriela Montero-...; Paul Gaytán; Mauricio Carrillo...; Francisco Barona-...
• Keywords: Physiology; Substrate specificity; Materials Science; Mechanosensitive Ion Channels in Physiology and Disease; Evolutionary biology; Biochemistry; Gene; Substrate Specificity; Evolution, Molecular; Computational biology; 03 medical and health sciences; Biochemistry, Genetics and Molecular Biology; Health Sciences; Materials Chemistry; Genetics; Histidine; Isomerases; Molecular Biology; Biology; Ecology, Evolution, Behavior and Systematics; Phylogeny; 0303 health sciences; Binding Sites; Bacteria; Macromolecular Crystallography Techniques; Protein Structure Prediction and Analysis; Isomerase; Ecology; Tryptophan; Life Sciences; Promiscuity; Markov Chains; Phylogenetics; Enzyme; FOS: Biological sciences; Physical Sciences; Enzyme Structure; Mutagenesis, Site-Directed; Metagenome; Medicine; Metagenomics; Substrate (aquarium); Research Article

Los enfoques actuales basados en secuencias para identificar cambios funcionales enzimáticos, como la promiscuidad enzimática, han demostrado ser altamente dependientes del conocimiento funcional a priori, lo que dificulta nuestra capacidad para reconstruir la historia evolutiva detrás de estos mecanismos. Los perfiles del modelo oculto de Markov (HMM), ampliamente utilizados para clasificar familias de enzimas, pueden ser útiles para distinguir entre familias de enzimas estrechamente relacionadas con diferentes especificidades. La familia de enzimas (βα) 8-isomerasa HisA/PriA, involucrada en la biosíntesis de L-histidina (HisA, monosustrato) en la mayoría de las bacterias y plantas, pero también en la biosíntesis de L-triptófano (HisA/TrpF o PriA, sustrato dual) en la mayoría de las Actinobacterias, se ha utilizado como sistema modelo para explorar hipótesis evolutivas y, por lo tanto, tiene una cantidad considerable de conocimiento evolutivo, funcional y estructural disponible. Buscamos intermediarios evolutivos funcionales entre las familias de enzimas HisA y PriA para comprender la divergencia funcional entre estas familias. Construimos un perfil HMM que clasifica correctamente las secuencias de función desconocida en las subfamilias de enzimas HisA y PriA. Usando este perfil HMM, extrajimos un metagenoma grande para identificar secuencias intermedias evolutivas plausibles entre HisA y PriA. Estas secuencias se utilizaron para realizar reconstrucciones filogenéticas y para identificar aminoácidos funcionalmente conservados. La caracterización bioquímica de una enzima seleccionada (CAM1) con una mutación dentro del sitio de unión a fosfato del extremo N funcionalmente esencial, a saber, una alanina en lugar de una glicina en HisA o una serina en PriA, mostró que este intermedio evolutivo tiene especificidad de sustrato dual. Además, la mutagénesis dirigida al sitio de este residuo de alanina, ya sea hacia atrás en una glicina o hacia adelante en una serina, reveló la robustez de esta enzima. Ninguna de estas mutaciones, presumiblemente sobre aminoácidos funcionalmente esenciales, abolió significativamente sus actividades enzimáticas. Se identificó una versión truncada de esta enzima (CAM2) que se predijo que adoptaría un (βα)6 veces y, por lo tanto, carecía por completo de un sitio de unión a fosfato en el extremo C, y se demostró que tenía actividad HisA. Como se esperaba, la reconstrucción de la evolución de PriA a partir de HisA con perfiles HMM sugiere que los cambios funcionales implican mutaciones en enzimas evolutivamente intermedias de residuos o motivos funcionalmente esenciales. Estos resultados concuerdan con un vínculo entre las enzimas promiscuas y la epistasis intragénica. HMM proporciona un enfoque conveniente para obtener información sobre estos procesos evolutivos.<br/>Les approches actuelles basées sur les séquences pour identifier les changements fonctionnels enzymatiques, tels que la promiscuité enzymatique, se sont révélées fortement dépendantes des connaissances fonctionnelles a priori, entravant notre capacité à reconstruire l'histoire évolutive derrière ces mécanismes. Les profils du modèle de Markov caché (HMM), largement utilisés pour classer les familles d'enzymes, peuvent être utiles pour faire la distinction entre des familles d'enzymes étroitement apparentées ayant des spécificités différentes. La famille des enzymes (βα) 8-isomérase HisA/PriA, impliquée dans la biosynthèse de la L-histidine (HisA, mono-substrat) chez la plupart des bactéries et des plantes, mais aussi dans la biosynthèse du L-tryptophane (HisA/TrpF ou PriA, double-substrat) chez la plupart des Actinobactéries, a été utilisée comme système modèle pour explorer les hypothèses évolutives et dispose donc d'une quantité considérable de connaissances évolutives, fonctionnelles et structurelles. Nous avons recherché des intermédiaires évolutifs fonctionnels entre les familles d'enzymes HisA et PriA afin de comprendre la divergence fonctionnelle entre ces familles. Nous avons construit un profil HMM qui classe correctement les séquences de fonction inconnue dans les sous-familles d'enzymes HisA et PriA. À l'aide de ce profil HMM, nous avons extrait un grand métagénome pour identifier des séquences intermédiaires évolutives plausibles entre HisA et PriA. Ces séquences ont été utilisées pour effectuer des reconstructions phylogénétiques et pour identifier les acides aminés fonctionnellement conservés. La caractérisation biochimique d'une enzyme sélectionnée (CAM1) avec une mutation dans le site de liaison au phosphate N-terminal fonctionnellement essentiel, à savoir une alanine au lieu d'une glycine dans HisA ou une sérine dans PriA, a montré que cet intermédiaire évolutif a une spécificité de double substrat. De plus, la mutagenèse dirigée de ce résidu alanine, soit en arrière dans une glycine, soit en avant dans une sérine, a révélé la robustesse de cette enzyme. Aucune de ces mutations, vraisemblablement sur les acides aminés fonctionnellement essentiels, n'a significativement aboli ses activités enzymatiques. Une version tronquée de cette enzyme (CAM2) prévue pour adopter un facteur (βα)6, et donc totalement dépourvue de site de liaison au phosphate C-terminal, a été identifiée et s'est révélée avoir une activité HisA. Comme prévu, la reconstruction de l'évolution de PriA à partir de HisA avec des profils HMM suggère que les changements fonctionnels impliquent des mutations dans des enzymes évolutivement intermédiaires de résidus ou motifs autrement fonctionnellement essentiels. Ces résultats sont en accord avec un lien entre la promiscuité enzymatique et l'épistasie intragénique. HMM fournit une approche pratique pour obtenir des informations sur ces processus évolutifs.<br/>Current sequence-based approaches to identify enzyme functional shifts, such as enzyme promiscuity, have proven to be highly dependent on a priori functional knowledge, hampering our ability to reconstruct evolutionary history behind these mechanisms. Hidden Markov Model (HMM) profiles, broadly used to classify enzyme families, can be useful to distinguish between closely related enzyme families with different specificities. The (βα)8-isomerase HisA/PriA enzyme family, involved in L-histidine (HisA, mono-substrate) biosynthesis in most bacteria and plants, but also in L-tryptophan (HisA/TrpF or PriA, dual-substrate) biosynthesis in most Actinobacteria, has been used as model system to explore evolutionary hypotheses and therefore has a considerable amount of evolutionary, functional and structural knowledge available. We searched for functional evolutionary intermediates between the HisA and PriA enzyme families in order to understand the functional divergence between these families.We constructed a HMM profile that correctly classifies sequences of unknown function into the HisA and PriA enzyme sub-families. Using this HMM profile, we mined a large metagenome to identify plausible evolutionary intermediate sequences between HisA and PriA. These sequences were used to perform phylogenetic reconstructions and to identify functionally conserved amino acids. Biochemical characterization of one selected enzyme (CAM1) with a mutation within the functionally essential N-terminus phosphate-binding site, namely, an alanine instead of a glycine in HisA or a serine in PriA, showed that this evolutionary intermediate has dual-substrate specificity. Moreover, site-directed mutagenesis of this alanine residue, either backwards into a glycine or forward into a serine, revealed the robustness of this enzyme. None of these mutations, presumably upon functionally essential amino acids, significantly abolished its enzyme activities. A truncated version of this enzyme (CAM2) predicted to adopt a (βα)6-fold, and thus entirely lacking a C-terminus phosphate-binding site, was identified and shown to have HisA activity.As expected, reconstruction of the evolution of PriA from HisA with HMM profiles suggest that functional shifts involve mutations in evolutionarily intermediate enzymes of otherwise functionally essential residues or motifs. These results are in agreement with a link between promiscuous enzymes and intragenic epistasis. HMM provides a convenient approach for gaining insights into these evolutionary processes.<br/>أثبتت الأساليب الحالية القائمة على التسلسل لتحديد التحولات الوظيفية للإنزيم، مثل الاختلاط الإنزيمي، أنها تعتمد بشكل كبير على المعرفة الوظيفية المسبقة، مما يعيق قدرتنا على إعادة بناء التاريخ التطوري وراء هذه الآليات. يمكن أن تكون ملفات تعريف نموذج ماركوف المخفي (HMM)، المستخدمة على نطاق واسع لتصنيف عائلات الإنزيمات، مفيدة للتمييز بين عائلات الإنزيمات المرتبطة ارتباطًا وثيقًا بخصائص مختلفة. تم استخدام عائلة إنزيم (βα) 8 - isomerase HisA/PriA، المشاركة في التخليق الحيوي L - histidine (HisA، أحادي الركيزة) في معظم البكتيريا والنباتات، ولكن أيضًا في التخليق الحيوي L - tryptophan (HisA/TrpF أو PriA، ثنائي الركيزة) في معظم البكتيريا الشعاعية، كنظام نموذجي لاستكشاف الفرضيات التطورية وبالتالي لديها قدر كبير من المعرفة التطورية والوظيفية والهيكلية المتاحة. بحثنا عن وسيطات تطورية وظيفية بين فصائل إنزيم HisA و PriA من أجل فهم الاختلاف الوظيفي بين هذه الفصائل. قمنا ببناء ملف تعريف HMM الذي يصنف بشكل صحيح تسلسلات الوظائف غير المعروفة إلى فصائل إنزيم HisA و PriA الفرعية. باستخدام ملف تعريف HMM هذا، قمنا بتعدين ميتاجينوم كبير لتحديد التسلسلات الوسيطة التطورية المعقولة بين HisA و PriA. تم استخدام هذه التسلسلات لإجراء عمليات إعادة البناء الوراثية وتحديد الأحماض الأمينية المحفوظة وظيفيًا. أظهر التوصيف الكيميائي الحيوي لإنزيم واحد مختار (CAM1) مع طفرة داخل موقع ربط N - terminus الفوسفات الأساسي وظيفيًا، أي ألانين بدلاً من الجليسين في HisA أو سيرين في PriA، أن هذا الوسيط التطوري له خصوصية ثنائية الركيزة. علاوة على ذلك، كشفت الطفرات الموجهة نحو الموقع لبقايا الألانين هذه، إما إلى الوراء في الجليكاين أو إلى الأمام في السيرين، عن قوة هذا الإنزيم. لم تلغ أي من هذه الطفرات، على الأرجح على الأحماض الأمينية الأساسية وظيفيًا، أنشطتها الإنزيمية بشكل كبير. تم تحديد نسخة مبتورة من هذا الإنزيم (CAM2) من المتوقع أن تتبنى (β)6 أضعاف، وبالتالي تفتقر تمامًا إلى موقع ربط الفوسفات C - terminus، وتبين أن لها نشاط HisA. وكما هو متوقع، فإن إعادة بناء تطور PriA من HisA مع ملامح HMM تشير إلى أن التحولات الوظيفية تنطوي على طفرات في الإنزيمات الوسيطة تطوريًا للمخلفات أو الزخارف الأساسية وظيفيًا. تتوافق هذه النتائج مع وجود صلة بين الإنزيمات المختلطة والمعرفة داخل الجين. يوفر نهجًا مناسبًا لاكتساب رؤى حول هذه العمليات التطورية.<br/>