Sekvenciranje sljedeće generacije (NGS) u Klinici za dječje bolesti Zagreb - što smo do sada naučili?

• DOI: 10.13112/pc.1048
• Publication Date: 2025-04-02T06:49:41Z
• Authors: Ljubica Odak; Katarina Vulin; Ana-Maria Meašić; Adriana Bobinec; Leona Morožin-Poh...

Tehnologija sekvenciranja sljedeće generacije (NGS, engl. next generation sequencing) omogućila je sekvenciranje više stotina gena, štoviše i cijelog genoma u jednom koraku što pokrenulo pravu revoluciju dijagnostici poremećaja s nasljednom podlogom. Pored dijagnostičke, NGS tehnologija značajne terapijske iskorake vidljivo na primjerima nasljednih za koje postoji ciljano liječenje (npr. epilepsije, metabolički poremećaji, maligne bolesti). Razvoju tehnologije uvelike doprinio napredak razvoju bioinformatičkih tehnika analize računalnih alata koji omogućuju obradu podataka dobivenih sekvenciranjem te analizu interpretaciju kliničke istraživačke svrhe. U svakodnevnoj praksi, dijagnostika odvija se kroz nekoliko faza; od inicijalnog uzimanja uzorka, izolacije DNA, kreiranja DNA knjižnice do samoga kojim dobivaju tzv. sirovi podaci (engl. raw data) potrebno analizirati. konstantno unaprjeđuje, počevši automatizacije pojedinih dijelova protokola razvoja kontrolu kvalitete varijanti kontinuirano ažuriraju podacima o novim genima, sadržaju genomskih literaturnih baza podataka. Svjesni svih benefita ove zdravstvenu skrb oboljelih, našoj Klinici dijagnostiku implementirali smo prije 7 godina, inicijalno uvođenjem kliničkog egzoma (CES, clinical exome zadnje vrijeme implementiranjem cjeloegzomskog (WES, whole sequencing). Iako riječ tehnologiji koja značajno unaprijedila svakodnevni rad, pravilnu primjenu važno poznavanje njenih ograničenja. Naime, poznato da ova ima ograničenu učinkovitost detekciji strukturnih sekvenciranju homolognih gena sa pseudogenima, GC bogatih regija repetitivnih regija. Na primjeru troje oboljelih prikazat ćemo neka ograničenja kojima susretali radu naglasiti važnost poznavanja dodatnih interpretaciji varijanti, fenotipizacije, drugih dijagnostičkih metoda mehanizama nastanka bolesti genomskoj razini. Primjer 1. Pacijentica dobi 17 godina dolazi primarne amenoreje, ageneze uterusa anomalije rodnice. Učinjeni kariogram bio 46,XY. Postavljena klinička dijagnoza sindroma neosjetljivosti androgene (AIS, androgen insensitivity syndrome) uzrokuju varijante genu AR, kodira androgeni receptor. Nakon CES metodom, računalni alat tercijarnu nije detektirao patološke promjene AR genu, no uvidom IGV preglednik Integrative Genomic Viewer) ustanovljen izostanak očitanja eksona 2-8/8 genu. Kromosomskim microarray-em potvrđena delecija kromosomu X regiji q12 veličine 96 kb zahvaća navedene eksone 2. 2 godine zbog koloboma šarenice, tetralogije Fallot, dismorfije razvojnog zaostajanja. sumnja CHARGE sindrom. Učinjena analiza prema HPO Human Phenotype Ontology) kodovima detektirala uzročnu patogenu varijantu. Naknadna WES pokazala heterozigotnu vjerojatno varijantu (PVS1, PM2) CHD7 (NM_017780.4): c.6718del, p. Asp2240MetfsTer37. Uvidom preglednik, varijanta vidljiva objema dijagnostičkim platformama (CES WES), ali ju tijekom odbacio premalog broja očitanja. 3. Pacijent 3 mikrocitne anemije makrokranije. metodom otkrivena patogena varijanta; 5 nukleotida poziciji c.95+2_95+6 utječe mjesto prekrajanja splice site) HBA1 i/ili HBA2 PP5, PM2). Geni su paralogni geni izraženom homologijom čega ovom short read) moguće definirati kojem dva nalazi navedena li homozigotnoj ili heterozigotnoj varijanti. Patogene oba povezuju hemoglobinopatijama - alfa talasemijom. dugih long bi definiranje zigotnosti varijanta.