Progesterone from the Cumulus Cells Is the Sperm Chemoattractant Secreted by the Rabbit Oocyte Cumulus Complex

• DOI: 10.1371/journal.pone.0003040
• Publication Date: 2008-08-21T19:35:41Z
• Authors: Héctor Alejandro ...; María Eugenia Teves; Diego Rafael Uñates; Agustín Anastasía; Laura Cecilia Gio...
• Keywords: Male; Oocyte; Cell biology; Science; Follicular fluid; Biochemistry; 03 medical and health sciences; Endocrinology; Cumulus oophorus; Health Sciences; Animals; Andrology; Male Reproductive Health; Biology; Internal medicine; Progesterone; Secretion; Diagnosis and Management of Polycystic Ovary Syndrome; 0303 health sciences; Cumulus Cells; Chemotactic Factors; Acrosome reaction; Chemotaxis; Q; R; Fertility Preservation in Cancer Patients; Public Health, Environmental and Occupational Health; Botany; Spermatozoa; Sperm DNA Fragmentation; Sperm; Chemistry; Reproductive Medicine; Embryo; Oocytes; Sperm Motility; Medicine; Female; Rabbits; Receptors, Progesterone; Immunocytochemistry; Research Article; Receptor

La quimiotaxis espermática en mamíferos se ha identificado hacia varias fuentes femeninas como el líquido folicular (FF), el líquido del oviducto y el medio acondicionado del cumulus oophorus (CU) y el ovocito (O). Aunque se confirmaron varias sustancias como quimioatrayentes de espermatozoides, la progesterona (P) parece ser el mejor candidato quimioatrayente, porque: 1) los espermatozoides expresan un receptor P de la superficie celular, 2) los espermatozoides capacitados son atraídos quimiotácticamente in vitro por gradientes de bajas cantidades de P; 3) las células CU producen y secretan P después de la ovulación; 4) un gradiente de P puede mantenerse estable a lo largo de la CU; y 5) el sitio más probable para la quimiotaxis de espermatozoides in vivo podría estar cerca y/o dentro de la CU. El objetivo de este estudio fue verificar si P es el quimioatrayente espermático secretado por el complejo ovocito-cúmulo de conejo (OCC) en el conejo, como modelo animal de mamífero. Mediante videomicroscopía y análisis de imágenes por ordenador observamos que solo las UC son una fuente estable de atrayentes espermáticos. La UC produce y secreta P ya que la hormona se localizó dentro de estas células mediante inmunocitoquímica y en el medio acondicionado mediante inmunoensayo enzimático. Además, los espermatozoides de conejo expresan un receptor P de la superficie celular detectado por transferencia Western y localizado en la región acrosómica por inmunocitoquímica. Para confirmar que P es el quimioatrayente espermático secretado por la CU, la respuesta quimiotáctica espermática hacia el medio acondicionado con OCC se inhibió mediante tres enfoques diferentes: P del medio acondicionado con OCC se eliminó con un anticuerpo anti-P, el gradiente de atrayente del medio acondicionado con OCC se interrumpió por un contra gradiente de P y el receptor P espermático se bloqueó con un anticuerpo específico. Concluimos que solo la UC pero no el ovocito segrega P, y este último quimioatrae los espermatozoides por medio de un receptor de superficie celular. Nuestros hallazgos pueden ser de interés en procedimientos de reproducción asistida en humanos, animales de importancia económica y especies en peligro de extinción.<br/>La chimiotaxie des spermatozoïdes chez les mammifères a été identifiée chez plusieurs sources féminines comme le liquide folliculaire (FF), le liquide oviducte et le milieu conditionné du cumulus oophorus (CU) et de l'ovocyte (O). Bien que plusieurs substances aient été confirmées comme chimioattractantes pour les spermatozoïdes, la progestérone (P) semble être le meilleur candidat chimioattractant, car : 1) les spermatozoïdes expriment un récepteur P de surface cellulaire, 2) les spermatozoïdes capacités sont attirés chimiotactiquement in vitro par des gradients de faibles quantités de P ; 3) les cellules CU produisent et sécrètent du P après l'ovulation ; 4) un gradient de P peut être maintenu stable le long de la CU ; et 5) le site le plus probable de chimiotaxie des spermatozoïdes in vivo pourrait être proche et/ou à l'intérieur de la CU. L'objectif de cette étude était de vérifier si P est le chimioattractant des spermatozoïdes sécrété par le complexe ovocyte-cumulus de lapin (OCC) chez le lapin, en tant que modèle animal mammifère. Au moyen de la vidéomicroscopie et de l'analyse d'images informatiques, nous avons observé que seule l'UC est une source stable d'attractifs pour les spermatozoïdes. L'UC produit et sécrète du P puisque l'hormone a été localisée à l'intérieur de ces cellules par immunocytochimie et dans le milieu conditionné par immunoessai enzymatique. De plus, les spermatozoïdes de lapin expriment un récepteur P de surface cellulaire détecté par Western blot et localisé sur la région acrosomale par immunocytochimie. Pour confirmer que P est le chimioattractant des spermatozoïdes sécrété par l'UC, la réponse chimiotactique des spermatozoïdes envers le milieu conditionné par l'OCC a été inhibée par trois approches différentes : P du milieu conditionné par l'OCC a été retiré avec un anticorps anti-P, le gradient attractif du milieu conditionné par l'OCC a été perturbé par un contre gradient P et le récepteur P des spermatozoïdes a été bloqué avec un anticorps spécifique. Nous avons conclu que seule la CU mais pas l'ovocyte sécrète P, et ce dernier chimioattracte les spermatozoïdes au moyen d'un récepteur de surface cellulaire. Nos résultats peuvent être intéressants dans les procédures de procréation assistée chez les humains, les animaux d'importance économique et les espèces en voie de disparition.<br/>تم تحديد الانجذاب الكيميائي للحيوانات المنوية في الثدييات تجاه العديد من المصادر الأنثوية مثل السائل الجريبي (FF)، وسائل قناة البيض، والوسط المكيف من ركام المبيض (CU) والبويضة (O). على الرغم من تأكيد العديد من المواد على أنها جاذبية كيميائية للحيوانات المنوية، يبدو أن البروجسترون (P) هو أفضل مرشح لجذب كيميائي، لأنه: 1) تعبر الحيوانات المنوية عن مستقبل P لسطح الخلية، 2) تنجذب الحيوانات المنوية المكثفة كيميائيًا في المختبر من خلال تدرجات كميات منخفضة من P ؛ 3) تنتج خلايا CU وتفرز P بعد الإباضة ؛ 4) يمكن الحفاظ على تدرج P مستقرًا على طول CU ؛ و 5) يمكن أن يكون الموقع الأكثر احتمالًا للانجذاب الكيميائي للحيوانات المنوية في الجسم الحي بالقرب من و/أو داخل CU. كان الهدف من هذه الدراسة هو التحقق مما إذا كان P هو الجاذبية الكيميائية للحيوانات المنوية التي يفرزها مركب بويضة الأرانب (OCC) في الأرانب، كنموذج حيواني للثدييات. من خلال الفحص المجهري بالفيديو وتحليل صور الكمبيوتر، لاحظنا أن الوحدة المركزية فقط هي مصدر ثابت لجذب الحيوانات المنوية. تنتج CU وتفرز P حيث تم تحديد موضع الهرمون داخل هذه الخلايا عن طريق الكيمياء المناعية وفي الوسط المشروط عن طريق المقايسة المناعية الإنزيمية. بالإضافة إلى ذلك، تعبر الحيوانات المنوية للأرانب عن مستقبل P لسطح الخلية الذي تم اكتشافه بواسطة البقعة الغربية وموضعه فوق منطقة الجسيم الطرفي بواسطة الكيمياء المناعية. للتأكد من أن P هو الجاذبية الكيميائية للحيوانات المنوية التي تفرزها CU، تم تثبيط الاستجابة الكيميائية للحيوانات المنوية تجاه الوسط المشروط بـ OCC من خلال ثلاث طرق مختلفة: تمت إزالة P من الوسط المشروط بـ OCC بجسم مضاد لـ P، وتعطل التدرج الجذاب للوسط المشروط بـ OCC بواسطة التدرج المضاد لـ P، وتم حظر مستقبل P للحيوانات المنوية بجسم مضاد محدد. وخلصنا إلى أن الوحدة المركزية فقط ولكن ليس البويضة هي التي تفرز P، والأخيرة تجذب الحيوانات المنوية كيميائياً عن طريق مستقبل سطح الخلية. قد تكون النتائج التي توصلنا إليها ذات أهمية في إجراءات الإنجاب المساعدة في البشر والحيوانات ذات الأهمية الاقتصادية والأنواع المهددة بالانقراض.<br/>Sperm chemotaxis in mammals have been identified towards several female sources as follicular fluid (FF), oviduct fluid, and conditioned medium from the cumulus oophorus (CU) and the oocyte (O). Though several substances were confirmed as sperm chemoattractant, Progesterone (P) seems to be the best chemoattractant candidate, because: 1) spermatozoa express a cell surface P receptor, 2) capacitated spermatozoa are chemotactically attracted in vitro by gradients of low quantities of P; 3) the CU cells produce and secrete P after ovulation; 4) a gradient of P may be kept stable along the CU; and 5) the most probable site for sperm chemotaxis in vivo could be near and/or inside the CU. The aim of this study was to verify whether P is the sperm chemoattractant secreted by the rabbit oocyte-cumulus complex (OCC) in the rabbit, as a mammalian animal model. By means of videomicroscopy and computer image analysis we observed that only the CU are a stable source of sperm attractants. The CU produce and secrete P since the hormone was localized inside these cells by immunocytochemistry and in the conditioned medium by enzyme immunoassay. In addition, rabbit spermatozoa express a cell surface P receptor detected by western blot and localized over the acrosomal region by immunocytochemistry. To confirm that P is the sperm chemoattractant secreted by the CU, the sperm chemotactic response towards the OCC conditioned medium was inhibited by three different approaches: P from the OCC conditioned medium was removed with an anti-P antibody, the attractant gradient of the OCC conditioned medium was disrupted by a P counter gradient, and the sperm P receptor was blocked with a specific antibody. We concluded that only the CU but not the oocyte secretes P, and the latter chemoattract spermatozoa by means of a cell surface receptor. Our findings may be of interest in assisted reproduction procedures in humans, animals of economic importance and endangered species.<br/>