Characterization of Glycolytic Enzymes - rAldolase and rEnolase of Leishmania donovani, Identified as Th1 Stimulatory Proteins, for Their Immunogenicity and Immunoprophylactic Efficacies against Experimental Visceral Leishmaniasis

• DOI: 10.1371/journal.pone.0086073
• Publication Date: 2014-01-24T21:33:29Z
• Authors: Reema Gupta; Vikash Kumar; Pramod Kumar Kush...; Chandradev Pati T...; Sumit Joshi; Amogh Anant Sahas...; Kalyan Mitra; Shyam Sundar; Mohammad Imran Si...; Anuradha Dube
• Keywords: Male; Models, Molecular; 0301 basic medicine; Epidemiology; Epidemiology and Treatment of Chagas Disease; Epitopes, T-Lymphocyte; Lymphocyte Activation; Prediction of Peptide-MHC Binding Affinity; Malaria vaccine; Biochemistry; Gene; Global Burden of Leishmaniasis Incidence and Treatment; Cricetinae; Fructose-Bisphosphate Aldolase; Parasite hosting; Hypersensitivity, Delayed; Leishmania infantum; Leishmaniasis; Visceral leishmaniasis; Leishmania; Q; R; Life Sciences; Mycobacterium bovis; Immunogenicity; 3. Good health; World Wide Web; Antigen; Cytokines; Leishmaniasis, Visceral; Medicine; Epitope; Glycolysis; Research Article; Science; Immunology; Plasmodium falciparum; Antigens, Protozoan; Nitric Oxide; 03 medical and health sciences; In vitro; Biochemistry, Genetics and Molecular Biology; Virology; Health Sciences; Animals; Amino Acid Sequence; Leishmaniasis Vaccines; Molecular Biology; Biology; FOS: Clinical medicine; In silico; Public Health, Environmental and Occupational Health; Peripheral blood mononuclear cell; Computer science; Malaria; Disease Models, Animal; Immune system; Immunoglobulin G; Leukocytes, Mononuclear; Leishmania donovani

Th1 immune responses play an important role in controlling Visceral Leishmaniasis (VL) hence, Leishmania proteins stimulating T-cell responses in host, are thought to be good vaccine targets. Search of such antigens eliciting cellular responses in Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from cured/exposed/Leishmania patients and hamsters led to the identification of two enzymes of glycolytic pathway in the soluble lysate of a clinical isolate of Leishmania donovani--Enolase (LdEno) and aldolase (LdAld) as potential Th1 stimulatory proteins. The present study deals with the molecular and immunological characterizations of LdEno and LdAld. The successfully cloned and purified recombinant proteins displayed strong ability to proliferate lymphocytes of cured hamsters' along with significant nitric-oxide production and generation of Th1-type cytokines (IFN-γ and IL-12) from stimulated PBMCs of cured/endemic VL patients. Assessment of their prophylactic potentials revealed ∼ 90% decrease in parasitic burden in rLdEno vaccinated hamsters against Leishmania challenge, strongly supported by an increase in mRNA expression levels of iNOS, IFN-γ, TNF-α and IL-12 transcripts along with extreme down-regulation of TGF-β, IL-4 and IL-10. However, animals vaccinated with rLdAld showed comparatively lesser prophylactic efficacy (∼ 65%) with inferior immunological response. Further, with a possible implication in vaccine design against VL, identification of potential T-cell epitopes of both the proteins was done using computational approach. Additionally, in-silico 3-D modelling of the proteins was done in order to explore the possibility of exploiting them as potential drug targets. The comparative molecular and immunological characterizations strongly suggest rLdEno as potential vaccine candidate against VL and supports the notion of its being effective T-cell stimulatory protein.<br/>تلعب الاستجابات المناعية Th1 دورًا مهمًا في السيطرة على داء الليشمانيات الحشوي (VL) وبالتالي، يُعتقد أن بروتينات الليشمانيا التي تحفز استجابات الخلايا التائية في المضيف، هي أهداف لقاح جيدة. أدى البحث عن مثل هذه المستضدات التي تثير الاستجابات الخلوية في الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMCs) من مرضى الليشمانيا والهامستر الذين تم شفاؤهم/تعريضهم إلى تحديد إنزيمين من مسار تحلل السكر في الحالة القابلة للذوبان لعزل سريري من الليشمانيا دونوفاني إينولاز (LdEno) والألدولاز (LdAld) كبروتينات محفزة محتملة من النوع TH1. تتناول هذه الدراسة الخصائص الجزيئية والمناعية لكل من LdEno و LdAld. أظهرت البروتينات المؤتلفة المستنسخة والمنقية بنجاح قدرة قوية على تكاثر الخلايا الليمفاوية للهامستر المعالج جنبًا إلى جنب مع إنتاج أكسيد النيتريك بشكل كبير وتوليد السيتوكينات من نوع Th1 (IFN - γ و IL -12) من خلايا PBMC المحفزة لمرضى VL المعالجين/المتوطنين. كشف تقييم إمكاناتهم الوقائية عن انخفاض بنسبة 90 ٪ في العبء الطفيلي في الهامستر الملقح ضد تحدي الليشمانيا، مدعومًا بقوة بزيادة في مستويات تعبير الحمض النووي الريبوزي المرسال لنصوص INOS و IFN - γ و TNF - α و IL -12 جنبًا إلى جنب مع التنظيم الشديد لـ TGF - β و IL -4 و IL -10. ومع ذلك، أظهرت الحيوانات التي تم تطعيمها بـ rLdAld فعالية وقائية أقل نسبيًا (65 ٪) مع استجابة مناعية أقل. علاوة على ذلك، مع وجود تأثير محتمل في تصميم اللقاح ضد VL، تم تحديد حواتم الخلايا التائية المحتملة لكلا البروتينين باستخدام النهج الحسابي. بالإضافة إلى ذلك، تم إجراء نمذجة ثلاثية الأبعاد للبروتينات من أجل استكشاف إمكانية استغلالها كأهداف دوائية محتملة. تشير الخصائص الجزيئية والمناعية المقارنة بقوة إلى rLdEno كمرشح محتمل للقاح ضد VL وتدعم فكرة كونه بروتين محفز فعال للخلايا التائية.<br/>Les réponses immunitaires Th1 jouent un rôle important dans le contrôle de la leishmaniose viscérale (CV). Par conséquent, les protéines de Leishmania stimulant les réponses des lymphocytes T chez l'hôte sont considérées comme de bonnes cibles vaccinales. La recherche de tels antigènes suscitant des réponses cellulaires dans les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) de patients et de hamsters guéris/exposés/Leishmania a conduit à l'identification de deux enzymes de la voie glycolytique dans le lysat soluble d'un isolat clinique de Leishmania donovani-Enolase (LdEno) et d'aldolase (LdAld) en tant que protéines stimulatrices potentielles Th1. La présente étude traite des caractérisations moléculaires et immunologiques de LdEno et LdAld. Les protéines recombinantes clonées et purifiées avec succès ont montré une forte capacité à proliférer des lymphocytes de hamsters guéris, ainsi qu'une production significative d'oxyde nitrique et une génération de cytokines de type Th1 (IFN-γ et IL-12) à partir de PBMC stimulées de patients atteints de CV guéris/endémiques. L'évaluation de leurs potentiels prophylactiques a révélé une diminution d'environ 90 % de la charge parasitaire chez les hamsters rLdEno vaccinés contre le défi Leishmania, fortement soutenue par une augmentation des niveaux d'expression de l'ARNm des transcrits iNOS, IFN-γ, TNF-α et IL-12 ainsi qu'une régulation à la baisse extrême du TGF-β, IL-4 et IL-10. Cependant, les animaux vaccinés avec rLdAld ont montré une efficacité prophylactique comparativement moindre (∼ 65 %) avec une réponse immunologique inférieure. De plus, avec une implication possible dans la conception du vaccin contre la CV, l'identification des épitopes potentiels des lymphocytes T des deux protéines a été effectuée à l'aide d'une approche informatique. De plus, une modélisation 3D in-silico des protéines a été réalisée afin d'explorer la possibilité de les exploiter comme cibles potentielles des médicaments. Les caractérisations moléculaires et immunologiques comparatives suggèrent fortement que rLdEno est un candidat vaccin potentiel contre la CV et soutiennent la notion de son efficacité en tant que protéine stimulatrice des lymphocytes T.<br/>Las respuestas inmunitarias Th1 desempeñan un papel importante en el control de la leishmaniasis visceral (VL), por lo tanto, se cree que las proteínas de Leishmania que estimulan las respuestas de las células T en el huésped son buenas dianas de vacunas. La búsqueda de dichos antígenos que provocan respuestas celulares en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de pacientes curados/expuestos/Leishmania y hámsters condujo a la identificación de dos enzimas de la vía glucolítica en el lisado soluble de un aislado clínico de Leishmania donovani--Enolasa (LdEno) y aldolasa (LdAld) como posibles proteínas estimuladoras de Th1. El presente estudio trata las caracterizaciones moleculares e inmunológicas de LdEno y LdAld. Las proteínas recombinantes clonadas y purificadas con éxito mostraron una gran capacidad para proliferar linfocitos de hámsters curados junto con una producción significativa de óxido nítrico y la generación de citocinas de tipo Th1 (IFN-γ e IL-12) a partir de PBMC estimuladas de pacientes con VL curados/endémicos. La evaluación de sus potenciales profilácticos reveló una disminución de ~ 90% en la carga parasitaria en hámsters vacunados con rLdEno contra la exposición a Leishmania, fuertemente respaldada por un aumento en los niveles de expresión de ARNm de los transcritos de iNOS, IFN-γ, TNF-α e IL-12 junto con una regulación negativa extrema de TGF-β, IL-4 e IL-10. Sin embargo, los animales vacunados con rLdAld mostraron una eficacia profiláctica comparativamente menor (~ 65%) con una respuesta inmunológica inferior. Además, con una posible implicación en el diseño de vacunas contra VL, la identificación de posibles epítopos de células T de ambas proteínas se realizó utilizando un enfoque computacional. Además, se realizó un modelado tridimensional in silico de las proteínas para explorar la posibilidad de explotarlas como posibles dianas farmacológicas. Las caracterizaciones moleculares e inmunológicas comparativas sugieren fuertemente rLdEno como posible candidato a vacuna contra VL y apoya la noción de que es una proteína estimulante de células T eficaz.<br/>