Modification of the method for analysis of genome editing results using CRISPR/Cas9 system on preimplantation mouse embryos

• DOI: 10.24075/brsmu.2016-03-02
• Publication Date: 2017-10-08T23:23:45Z
• Authors: T. V. Dimitireva; D. A. Reshetov; ; V. E. Zhernovkov; ; D. E. Vlodavets; ; E. D. Zotova; ; T. G. Ermolkevich; ; ; A. V. Deykin
• Keywords: genome editing, CRISPR/Cas9, short nucleotide insertions, nucleotide deletions, mouse embryos, Duchenne muscular dystrophy; 0301 basic medicine; 03 medical and health sciences

Генно-модифицированные животные — важный инструмент биомедицинских исследований. Для их получения все чаще используют систему редактирования генома CRISPR/Cas9. С помощью микроинъекции комплекс РНК-гида и белка Cas9 доставляется в оплодотворенную яйцеклетку, из которой впоследствии развивается животное с модификацией в геноме. Как правило, анализ специфичности и эффективности системы в каждом случае проводят после получения потомства с вероятной мутацией. Однако анализ на предимплантационной стадии позволил бы сократить время эксперимента, а также понять причину рождения малого числа или даже отсутствия трансгенных особей в потомстве. В статье предложена модификация метода подготовки тотальной ДНК из бластоцист мыши, позволяющая проще и быстрее детектировать результаты микроинъекций комплекса CRISPR/Cas9 в зиготу. Применив описанный в статье метод, мы успешно идентифицировали короткие делеции в интроне 34 гена дистрофина (DMD) в 12 из 13 обработанных эмбрионов и вставку по месту разрыва в интроне 8 гена DMD в 11 из 21 проанализированных образцов. Используя приготовленную предложенным способом тотальную ДНК, можно анализировать до 20 различных сайтов в геноме мышиного эмбриона на стадии бластоцисты, не прибегая к полногеномной амплификации.<br/>Genetically modified animals are an important tool for biomedical research. The CRISPR/Cas9 editing genome system is increasingly being used for production of such animals. Through microinjection, complex with guide RNA and Cas9 protein is delivered in fertilized eggs from which the animal subsequently develops with a modification in the genome. Generally, analysis of the specificity and efficiency of the system in each case is carried out after obtaining a progeny with the likely mutation. However, analysis at the preimplantation stage would allow reducing the time of the experiment, as well as understanding the reason for the birth of a small number of transgenic animals, or even lack of them in the offsprings. The paper proposes a modification of the method of preparation of total DNA from mouse blastocysts. The modification allows to easier and faster detect the results of microinjection of the CRISPR/Cas9 complex in the zygote. Having applied the method described in this paper, we successfully identified short deletions in intron 34 of dystrophin gene (DMD) in 12 out of 13 treated embryos and insertion in the break site in intron 8 of the DMD gene in 11 out of 21 samples analyzed. Using for analysis the total DNA prepared by the method proposed, you can analyze up to 20 different sites in the mouse embryo genome at the blastocyst stage without the need for full genomic amplification.<br/>